科研 | Science：饮食调控肠-肾轴的新机制
编译：北越城主，编辑：Tracy、江舜尧。
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前期大量研究发现慢性肾脏疾病(CKD)和肠道菌群之间的存在联系，但其潜在机制仍不清楚。在人类中，饮食中蛋白会通过肠道细菌产生硫化氢(H2S)、吲哚和吲哚硫酸盐，而这些代谢产物属于尿毒症毒素，它们中的一些是通过翻译后修饰介导的。在CKD的小鼠模型中，我们发现含高硫氨基酸的饮食导致了翻译后修饰的微生物色氨酸酶活性改变，这减少了尿毒症毒素的产生并改善了小鼠CKD的发展，因此，饮食可以通过翻译后修饰来调整微生物群的功能，以支持健康的宿主生理，而不改变微生物群落的组成。
论文ID
实验设计
实验结果
慢性肾脏病（CKD）影响全球近8.5亿人，虽然饮食调整是CKD治疗的基石，但在CKD发病机理和治疗中饮食与微生物群相互作用的机制作用尚未得到充分研究。目前，许多饮食-微生物组的研究集中于饮食纤维，脂肪和碳水化合物的影响，而关于膳食蛋白质和氨基酸的所发挥的具体作用研究甚少，在膳食氨基酸中有5％到10％到达发生肠道菌群代谢的结肠中。对于人类来说，增加饮食中蛋白质摄入会增加肠道细菌产生更多的硫化氢（H2S），吲哚和吲哚酚硫酸盐，其中吲哚和吲哚酚硫酸盐是尿毒症毒素，而H2S具有多种生理功能，其中一些功能是由翻译后修饰S-硫酸化作用介导的。虽然科研人员已在哺乳动物系统中进行了大量研究，但仍未充分研究H2S在调节宿主内肠道细菌功能方面的生理作用，此外，人们也尚不清楚是否存在通过控制饮食与微生物相互作用来改善CKD的可能。
数十年来，改变患者饮食中蛋白质的摄入量一直是治疗CKD的临床策略，确切地说，饮食中含硫氨基酸（Saa）的摄入量会影响患者和疾病模型的CKD进展。而饮食蛋白，肠道微生物代谢和H2S之间如何相互影响尚不明确，并且为了解决肠道微生物代谢和饮食在肾功能中的作用，我们使用了基于Saa饮食干预的CKD小鼠模型。我们制定了等热量饮食来代表小鼠Saa饮食的极端情况，即低或高蛋氨酸和半胱氨酸的饮食，但蛋氨酸摄入量是足够的以避免蛋氨酸代谢限制。在常规饲养中，与无特定病原体（SPF）小鼠高Saa + Ade（腺嘌呤）饮食相比，SPF小鼠低Saa + Ade饮食的血清肌酐水平显着升高（图1A），并且范围更广，也出现了严重的肾皮质组织病理学改变，包括肾小管扩张和脱落，肾小管炎伴肾小管周围纤维化以及皮质晶体沉积（图1，B至D）。为了确定Saa效应在多大程度上取决于肠道菌群，我们将Saa + Ade饮食饲喂了经过生化培养的无菌（GF）小鼠，与低Saa + Ade饮食的SPF小鼠相比，GF小鼠的血清肌酐和肾脏损害明显减少，并且在高Saa + Ade饮食的GF和SPF小鼠中存在相似的表型（图1，A 至D）。考虑到低Saa + Ade饮食的GF小鼠虽然比SPF小鼠少，但仍显示出肾脏损伤，我们在人和小鼠腺嘌呤模型中检查了一组与CKD发病有关的宿主基因的表达。在低Saa + Ade饮食下，GF小鼠中的Spp1（骨桥蛋白），Tgfb1和Icam1的含量高于SPF小鼠，而在低Saa + Ade饮食的SPF小鼠中，Ccl2和Timp1的增加程度更大。这些数据表明微生物群可以缓冲某些宿主基因的表达，同时刺激其他宿主基因的表达。总而言之，我们发现低Saa饮食会加剧观察到的CKD表型，而肠道菌群的存在会进一步放大这些影响。
我们通过半胱氨酸向H2S的微生物代谢测试了饮食Saa和肠道细菌之间是否存在联系。我们通过同时使用乙酸铅和亚甲基蓝硫化物检测方法测量了低和高Saa饮食的GF和SPF小鼠的盲肠硫化物水平，高Saa饮食SPF小鼠的盲肠硫化物水平高于低Saa饮食的小鼠（图1，E和F），无论Saa饮食如何，GF小鼠盲肠的硫化物含量均显着低于SPF小鼠（图1，E和F）。我们未观察到16S rRNA基因扩增子测序分析在低剂量高Saa中SPF小鼠之间肠道菌群成员的分类学丰度有任何显着差异，这支持了健康小鼠盲肠硫化物的差异可能是由微生物功能的改变而不是微生物群落结构的改变介导的观点。
图1 饮食中的Saa和肠道菌群调节CKD小鼠肾脏损伤的严重程度
(A)在低/高saa +Ade组SPF和GF小鼠(Cre) 血清肌酐水平的变化。(B和C)小鼠肾脏的H&E染色(B)和三色染色(C)。(D)基于组织学的肾脏损伤评分。(E和F) SPF (E)和GF (F)小鼠盲肠硫化物含量。(G)正常组与CKD患者样本中的大肠杆菌基因丰度变化。(H) 在低和高saa +Ad饮食中ASF或ASFE. coli小鼠血清肌酐水平变化。(I和J)小鼠肾脏的代表性H&E染色(I)和三色染色(J)。(K)基于组织学的肾脏损伤评分。(L和M) ASF和ASFE. coli小鼠盲肠硫化物水平。
为了更有效地模拟CKD患者可能发生的肠道微生物活动变化目标，我们找到了可公开获得的CKD患者肠道菌群进行分析研究，以鉴定与健康个体相比CKD患者富含的菌群类别。我们重新分析了徐等人的粪便16S rRNA基因扩增子数据集以及来自南方医科大学（NCBI登录，编号PRJEB5761），由Vaziri等人进行的粪便PhyloChip研究，和来自Promegene转化研究所（PTRI）的粪便全基因组shot弹枪测序数据集（NCBI登录号PRJNA449784）。严格的统计的结果（线性判别分析（LDA）得分> 4，倍数变化（FC）> 2）显示了CKD患者中Enterobacteriaceae富集清晰而可靠的信号。虽然16S rRNA基因扩增子分析不能提供菌株水平的大肠杆菌鉴定，但PhyloChip分析显示，与对照相比，在患有终末期肾脏疾病的CKD患者的粪便样本中测得的7种大肠杆菌的总平均丰度显着增加。我们对PTRI全基因组shot弹枪测序数据集的进一步分析加强了这一发现，因为我们发现CKD患者样品中的E. coli平均基因丰度比非CKD对照更高（图1G）。鉴于从人类CKD肠道菌群的重新分析以及大肠杆菌的遗传易加工性和相对表征好的蛋白质组学得出的这些发现，我们着重研究了大肠杆菌在腺嘌呤驱动的CKD模型中的作用。由于我们从杰克逊实验室（Jackson Laboratory）获得的小鼠体内不含任何Enterobacteriaceae菌群，并且为了在可复制的模型系统中进行细致的肠道微生物活性对照研究，我们使用了无菌小鼠定植了特殊的肉汤培养基的菌群（ASF）里面添加了E. coli K-12，ASF是由8个细菌组成的简化的微生物群落，它们与Enterobacteriaceae无关。我们使用ASF小鼠，而不是单结肠小鼠，是因为ASF小鼠在生理上与SPF小鼠更相似。在有和没有腺嘌呤的低和高Saa饮食中，大肠杆菌的定殖情况相似，我们没有观察到ASF成员的相对丰度发生变化；在低Saa + Ade饮食下，定植于大肠杆菌（ASFE.coli）的ASF小鼠比ASF小鼠具有更高的血清肌酐和更广泛的肾小管炎，肾小管萎缩和脱落，肾小管周围纤维化和皮质晶体（图1，H 至K），然而，ASFE.coli与低Saa + Ade饮食的同窝仔相比，高Saa + Ade饮食的大肠杆菌和ASF小鼠具有相似的血清肌酐水平和较轻的肾实质病理（图1，H至K），与SPF小鼠一样，我们发现高和低Saa + Ade饮食ASFE.coli小鼠的盲肠硫化物水平较高（图1，L和M）。为了确定在没有腺嘌呤损伤的情况下这些模型中是否会发生肾功能改变，我们检查了在低Saa饮食和高Saa饮食下的SPF和ASFE.coli中的血清肌酐水平，发现低Saa饮食和E. coli足以增加小鼠的血清肌酐水平，并且没有明显的组织学异常，我们用Saa饮食的SPF小鼠也获得了相似的结果。综上，这些结果支持E. coli与Saa饮食相互作用以调节肾脏功能。
鉴于我们对Saa日常饮食中SPF和ASFE.coli小鼠盲肠H2S的观察，以及阅读了有关H2S如何在翻译后修饰哺乳动物蛋白质从而导致一系列生理作用的文献，我们研究了H2S对大肠杆菌的影响。在乙酸铅硫化物检测分析中，需氧或厌氧生长的大肠杆菌以剂量依赖性方式从半胱氨酸产生硫化物，而对生长没有任何影响（图2A）。为了控制内源性H2S产生对大肠杆菌生理的影响，我们编辑了一个等基因株，带有decR缺失，该残基编码了半胱氨酸脱氢酶基因yhaO和yhaM的转录激活因子，在E. coli中驱动着半胱氨酸衍生的硫化物的产生，decR的删除导致硫化物的产生显着减少，而对生长动力学没有影响（图2，A和B）。据报道，SseA（3-巯基丙酮酸硫转移酶）是E. coli中半胱氨酸衍生的硫化物的主要来源，但并未影响我们系统中硫化物的产生，硫化物发挥作用通过生成修饰半胱氨酸残基的多硫化物，导致S硫磺化。为了鉴定S-硫酸化的大肠杆菌蛋白质（R-S-S），我们采用了一种下拉法，专门富集S-硫酸化的蛋白质，该技术利用了马来酰亚胺与游离硫醇和过硫化物的结合，从而形成了硫醚键，以及二硫苏糖醇（DTT）打破二硫键的能力（图2C）。我们观察到，在补充有半胱氨酸的培养基中生长的野生型（WT）大肠杆菌裂解物的DTT洗脱样品中，水合蛋白的富集度很高（图2D）。我们验证了下拉测定法的特异性并发现用H2O2处理细菌裂解液并因此氧化游离硫醇会降低S-亚硫酸化蛋白的检测率，但是用快速反应的硫化物供体氢硫化钠（NaHS）进行处理，我们可在细菌裂解液中诱导更高的S-硫酸化水平。
我们发现，在补充了半胱氨酸的中等培养基中生长的E. coli裂解物中，S-硫代水合的水平要高于仅在Luria肉汤（LB）中生长的大肠杆菌，相比之下，在半胱氨酸补充的LB肉汤中生长的decR细菌与野生的E. coli相比，产生较少H2S的裂解物，显示出更少的S-硫酸化作用（图2E）。接下来，我们试图使用TMT定量标记方法分析来表征E. coli的亚硫酸氢盐，该分析表明，与未用DTT处理的相同样品相比，用DTT处理的E. coli裂解物能鉴定出更多富集的蛋白质（图2F），此外，大多数野生型decR E. coli检测到富含S-巯基化蛋白质，这是由于该菌株从半胱氨酸产生硫化物的能力不同所致。通过它们的q值（DTT与非DTT）对S-硫酸化蛋白进行排名显示出了十大最丰富的S-硫酸化蛋白（图2F），尽管大多数这些蛋白质在对数生长的细菌生长过程中都高度表达并有望高度丰富，但色氨酸酶（TnaA）却被过度产生。总而言之，我们的定量蛋白质组学分析确定了212种S-巯基化的蛋白质，具有很高的可信度，超几何分布分析揭示了13种富含S-巯基化蛋白质的细胞途径，其中一些与蛋白质翻译有关。
图2 E. coli s -巯基化的特性表明TnaA是一种高度s -巯基化的蛋白
(A) 大肠杆菌硫化物的产生，用乙酸铅测定。(B) 大肠杆菌硫化物的产生，用亚甲基蓝测定。(C) s -硫酸蛋白下拉法示意图。硫化蛋白以蓝色突出显示，以区别于红色的天然蛋白。(D)对大肠杆菌裂解液进行s -硫酸盐下银染色，并使用或不使用DTT洗脱。(E) WT型或decR E. coli型裂解物的银染色。（F）用TMT标记蛋白分析WT大肠杆菌样品和DTT洗脱的DdecR突变体样品的s -硫化物下拉组分中212 s -硫化物蛋白的相对数量的热图。
TnaA（图2F）是一种催化色氨酸降解为吲哚，丙酮酸和氨的分泌酶，在我们的S-硫氢酶分析与我们在CKD小鼠模型中观察到的表型之间可能存在联系。吲哚是一类细菌产生的分子，不仅调节细菌生理，而且参与细菌与宿主的相互作用，吲哚也可以通过门静脉被运输到肝脏，在那里被氧化，产生尿毒症毒素吲哚酚硫酸盐。由于这些原因，TnaA成为研究CKD小鼠模型中宿主与微生物相互作用的热门靶标，我们在其天然启动子下用克隆的TnaA-his替换了大肠杆菌TnaA染色体拷贝，然后，我们通过使用Western印迹分析法分析WT与decR E. coli裂解物中的TnaA S-硫酸化，从而验证了我们的S-硫酸氢盐结果，发现decR裂解物中的TnaA S-硫酸化减少（图3A），而我们用H2O2和NaHS处理的E. coli裂解物分别显示出TnaA S硫酸盐减少和增加（图3B）。由于S-硫酸化下拉法会减少S-硫酸化的半胱氨酸残基（即去除S-硫酸化），因为TnaA具有七个半胱氨酸所以我们无法查明S-硫酸化的确切半胱氨酸残基，因此，我们从生长在补充了半胱氨酸的LB中的大肠杆菌中纯化了天然表达的TnaAHis，并进行了LC-MS / MS分析，以检测和绘制S-巯基化反应。我们检测到几种TnaA-His肽，它们具有+32 Da，与半胱氨酸残基上S-巯基化的分子量相匹配。我们不能排除半胱氨酸残基氧化为亚磺酸(R-S-O2)导致了相同的质量位移发生的可能性，并且在我们的分析中给出了氧化的可能。但是，S-硫代半胱氨酸可被氧化为亚硫酸（R-S-S-O2），导致+ 64-Da的增加，这是由S-硫酸化的半胱氨酸氧化或第二次硫酸化（R-S-S-SH）引起的。我们能够在TnaA的几个半胱氨酸残基中检测到+ 64-Da的变化，尽管我们发现7个TnaA半胱氨酸（C）残基中有6个被S硫磺化（C148，C281，C294，C298，C352和C383），但我们不能排除半胱氨酸残基C413也被S硫磺化，因为我们对TnaA的覆盖率（-78％）不包括该区域内高信度的肽，TnaA半胱氨酸残基参与其酶促活性，因为C298突变导致TnaA活性改变。为了研究S硫磺化对TnaA活性的影响，我们通过Kovac试剂法和细菌培养物的LC-MS / MS分析。我们发现，用半胱氨酸或NaHS补充LB肉汤可降低上清液中的吲哚浓度（图3，C和D），此外，为支持硫化物在TnaA抑制中的作用，当在补充半胱氨酸的LB中生长时，decR E. coli的吲哚水平高于野生型，并且在这些条件下TnaA的表达相似。为了显示吲哚的产生依赖于TnaA，我们使用同基因的tnaA739 :: kan突变体（tnaA mut）消除了TnaA活性，并且未在培养上清液中检测到吲哚。为了测试S-硫酸盐化直接抑制TnaA活性的方法，我们使用了纯化E. coli TnaA的还原剂方法，我们观察到与多硫化物供体四硫化二钠（Na2S4）的孵育导致TnaA S-硫酸盐化体外酶活性降低60％（图3E）。作为测定的对照，我们添加了DTT，它应该将S巯基化的TnaA还原为其功能性天然形式，我们观察到TnaA活性超过三倍（图3E）。为了为半胱氨酸来源的硫化物抑制TnaA提供更多的生理环境，我们测量了从用半胱氨酸生长的WT和decR大肠杆菌培养物中纯化的TnaA的活性，发现TnaADdecR具有更高的活性。总之，在体外和细菌培养中这些结果支持大肠杆菌TnaA的硫酸化降低其活性。
图3 s-巯基化抑制E.coli TnaA吲哚产生酶活性
（A）代表Western blot分析WT和decR大肠杆菌裂解液中的TnaA-His的表达。(B)方法与(A)相同，但用NaCl、H2O2或NaHS处理大肠杆菌裂解物。(C) LC-MS/MS分析含有半胱氨酸或NaHS的WT大肠杆菌培养物中的吲哚。(D和E) Kovac测定培养的WT大肠杆菌中用半胱氨酸或NaHS吲哚的产生量(D)或纯化的TnaA酶补充了NaCl, Na2S4，或DTT处理吲哚的产生量 (E)。
尽管我们在体外从细菌细胞裂解物中检测到了纯化的蛋白质和TnaA的TnaA S硫酸盐化反应，并证明了这种修饰抑制了其活性，但我们尚未确定这种翻译后修饰是否发生在肠道内响应饮食性Saa并导致可测量的对宿主的生理后果。为了对此进行调查，我们首先向ASF E.colimice小鼠提供高和低Saa饮食，尽管饮食中的小鼠具有相似水平的大肠杆菌，但我们发现高Saa饮食中小鼠盲肠中的TnaA S-硫酸化程度高于低Saa饮食中小鼠（图4A），八个ASF细菌基因组均未编码tnaA基因，并且使用LC-MS / MS无法检测ASF小鼠盲肠内容物中的吲哚，这表明大肠杆菌是该模型中吲哚的唯一生产者。利用这种区别，我们测量了两种饮食中ASF E.colimice盲肠中的吲哚含量。我们发现采用高Saa饮食的小鼠的吲哚水平显着降低，这表明高饮食Saa不仅增加了TnaA S的硫酸化作用，而且这种修饰足以影响体内TnaA的活性（图4，B和C）。为了研究饮食，微生物代谢和肾脏损害之间的联系，我们通过使用低Saa + Ade饮食CKD小鼠模和之前使用过的无菌ASF小鼠来研究其联系。我们使用了定植这些小鼠任意的野生E. coli (ASFE.coli)，或具有两个同基因突变体之一，即tnaA mut或decR（分别为ASFtnaA mut或ASFdecR），与ASFE.coli小鼠不同，在ASFtnaA mut小鼠的血清中未检测到吲哚酚硫酸盐，因为肠道菌群中不存在色氨酸酶。由于E. coli decR不足以从半胱氨酸生产硫化物，因此TnaA的亚硫酸氢盐含量较低，活性更高。与该观察结果一致，相对于ASFE.coli小鼠，ASFdecR小鼠显示出盲肠硫化物减少，盲肠吲哚增加和血清硫酸吲哚酚增加（图4D）。野生型E. coli定植的小鼠的血清肌酐水平高于TnaA mut菌株定植的小鼠（图4E），伴随血清吲哚酚硫酸盐水平升高，定植于decR株的小鼠血清肌酐水平最高（图4E），而三种不同的大肠杆菌菌株的定殖相似。组织学发现，更严重的肾小管间质损害，纤维化，皮质晶体沉积和实质性广泛侵犯，反映了大肠杆菌decR与野生型大肠杆菌相比，吲哚硫酸盐和肌酐的趋势（图4，F和G）。我们还用高Saa + Ade饮食检验了这些小鼠，与先前的观察结果一致（图1），采用这种饮食的ASFE.coli小鼠表现出较轻的表型，尽管与亲本和tnaA mut菌株相比，ASFdecR小鼠的血清肌酐略有增加。总体而言，这些数据支持饮食成分可以产生影响肠道外宿主功能的肠道微生物蛋白的翻译后修饰，并且我们的发现还提供了关于宿主-饮食-微生物群相互作用如何导致疾病状态（例如CKD）的机制性见解。
图4 在CKD小鼠模型中，Saa饮食可调节盲肠吲哚水平、血清吲哚硫酸酯水平和肾功能
(A和B)用 Western blot分析盲肠内容物中TnaA的表达 (C) LC-MS/MS分析ASFE. coli小鼠盲肠内容物中吲哚水平。(D) LC-MS测定低saa +Ade饮食和大肠杆菌定植的ASF小鼠血清中硫酸吲哚酚的含量。(E)大肠杆菌定植的ASF小鼠血清肌酐(Cre)水平变化。
我们发现，源自饮食Saa细菌代谢的硫化物通过抑制S-巯基化色氨酸酶来调节大肠杆菌的吲哚生产。我们的研究表明，饮食成分可以被微生物群代谢，从而产生微生物蛋白的翻译后修饰，从而影响宿主的生理，并为宿主-饮食-微生物群之间的相互作用如何促进或阻止诸如CKD的疾病状态提供了框架。尽管宏转录组学已为微生物群体的功能变化提供了研究窗口，但我们的结果表明，对一种特定蛋白质的单一修饰可以介导这种作用。因此，在我们的小鼠CKD模型中，饮食变化（不会导致微生物成分变化）表明，大肠杆菌产生的吲哚受到肠道细菌内源性产生的硫化物含量的差异影响。我们的工作表明细菌代谢不仅可能对宿主生理产生直接影响，而且还可能影响宿主饮食介导的细菌翻译后修饰驱动的微生物相互作用。我们的观察表明，虽然无菌小鼠在腺嘌呤模型中表现出肾衰竭表型，但比SPF小鼠要轻，这表明宿主因素以及氧化还原状态（例如，谷胱甘肽水平的改变）在饮食Saa中也起调节肾功能作用。不依赖吲哚的饮食Saa对肾功能的影响还可以通过在E.coli tnaA mut株中定植的ASF小鼠的表型来表明，这些小鼠缺乏吲哚和吲哚酚硫酸盐，但在Saa + Ade饮食中仍表现出CKD表型，因此，饮食中Saa和细菌TnaA吲哚产生对人CKD肾衰竭的贡献值得进一步研究，盲肠吲哚的2倍增加最终在小鼠CKD模型中血清吲哚酚硫酸盐增加10倍。腺嘌呤CKD小鼠模型中吲哚非依赖性的机制可能会导致硫酸吲哚酚的增加，从而导致其在血清中的排泄和积累减少，另外，盲肠中吲哚生成的动力学可以通过吲哚在肝脏中的氧化和积累以及释放到血清中的速率来增强。
总之，饮食是控制CKD的关键方面，我们假设施用TnaA抑制剂（例如硫化物供体）可以帮助降低肠道吲哚水平，从而减轻肾脏损害。为了支持这一概念及其广泛应用，其他肠道细菌，尤其是门细菌杆菌的成员，也编码TnaA同源物，并且细菌TnaA等位基因之间存在高度同源性。我们的研究阐明了饮食，微生物代谢和肾脏功能之间的相互作用，这是由翻译后蛋白质调控介导的，这些发现可能为控制CKD提供了亮点，并为改善人类健康提供了针对微生物群及其蛋白质组酶活性的临床方法。
结论
1.在慢性肾病（CKD）模型小鼠中，高Saa（含硫氨基酸）饮食能增加盲肠硫水平，并减轻CKD症状和肾损伤；
2.饮食中的Saa含量高低对小鼠肠道菌群组成影响不大，但其被菌群代谢产生的硫化物能通过调节蛋白质硫巯基化修饰来影响细菌功能；
3.在CKD患者肠道中富集的大肠杆菌，其分泌的酶TnaA可分解色氨酸产生吲哚；
4.高Saa饮食导致TnaA硫巯基化修饰水平升高，抑制其活性，这减少了肠内吲哚生成，降低尿毒素硫酸吲哚酚水平，从而减少CKD小鼠肾损伤。