综述 | Gut Microbes：胃肠道微生物在胃癌中的作用
编译：团子菌，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在全球范围内，胃癌是癌症的主要死亡原因之一。幽门螺杆菌(H.pylori)感染是胃癌的最大危险因素。由于检测技术的不断发展，研究人员开始研究幽门螺杆菌以外的胃部微生物在胃癌发生过程中的潜在作用。最近，研究人员通过分析不同阶段胃癌患者的胃微生物组成发现与胃部健康的个体相比，胃中部分定植菌与胃癌发生相关。基于胰岛素-胃泌素(INS-GAS)转基因小鼠模型的研究为深入探索胃微生物与胃癌的关联程度奠定基础。本文的目的是对胃微生物与胃癌的文献现状进行综述。
论文ID
原名：The role of gastric microbiota in gastric cancer
译名：胃肠道微生物在胃癌中的作用
期刊：Gut Microbes
IF：7.823
时间：2019.6.10
通讯作者：2020.4
通讯作者单位：YuChen
主要内容
胃癌是全球第五大常见癌症，2018年有超过1,000,000的新发病例。幽门螺杆菌(Hp)感染是与胃癌相关的最强危险因素之一。全球有超过50%以上的个体有Hp感染，几乎所有胃癌的发生都与Hp感染相关。大部分胃癌是非贲门胃癌中的肠型胃癌，其发展过程包括萎缩性胃炎（AG）、肠上皮化生（IM）和胃癌（GC）。众所周知，Hp感染在胃癌发生过程中起重要作用。Hp感染会引起胃粘膜炎症，破坏胃的盐酸分泌腺，最终导致萎缩性胃炎。萎缩性胃炎是一种慢性的炎症、低氯血状态，可导致胃癌的发生。虽然Hp感染与胃癌发生发展相关，但是仅1-3%的Hp感人个体最终会发展为胃癌。胃癌的其他危险因素包括高龄、男性、特殊宗教信仰和环境因素（吸烟、高盐饮食、含氮腌制食品）等。促炎基因内的遗传多态性也与胃癌的发生有关。然而，胃微生物与胃癌之间的关系仍不清楚。据推测，与萎缩性胃炎相关的次氯酸钠可使口腔和肠道下层的微生物在胃中定植，而这些微生物在正常的酸性条件下通常是不存在的。由于培养胃共生微生物较难，早期的胃部菌群研究受限。因此，早期研究认为能够在胃中存活的微生物数量有限。然而，随着高通量测序技术的发展，研究发现胃中富含大量微生物，同时关于胃部菌群与胃癌的相关研究逐渐兴起。因此，为未来研究提供方向，有必要整理既往研究结果。
1 胃癌的发生和菌群多样性
高通量测序技术的不断发展为更好地研究胃部菌群提供可能，更重要的是，为动态探索从健康发展到胃癌的过程中胃部菌群组成变化提供可能 (表1)。到目前为止，绝大多数关于胃部菌群的研究都集中在肠型胃癌而不是弥漫型胃癌，这可能是因为与弥漫型胃癌相比，幽门螺杆菌感染与肠型胃癌相关性更高。2006年Bik等人的研究是胃部菌群研究领域的里程碑式研究，该研究通过检测胃镜检查中收集的胃部活检组织标本，描述23名成年人胃部菌群特征。该研究发现128个细菌分型同时发现胃部菌群主要包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门。实际上，该研究发现的128个细菌分型中有64个无法经传统培养方法培养。虽然该研究存在样本量小、男女比失衡（23名成年人中22名为男性）等局限性，但是该研究为第一项揭示胃部富含大量微生物以及包括不同类型微生物的研究。同样值得注意的是，这项研究发现了几例经传统诊断试验诊断为Hp阴性的患者的胃活检组织中实际存在幽门螺杆菌。这一发现表明，胃部疾病患者中Hp感染情况可能被低估。
虽然上述研究证实胃部富含微生物，但是研究对象均为具有消化不良等症状而接受胃镜检查的相对健康个体。还有一些研究纳入健康、AG、IM和GC多组研究对象进行胃微生物多样性差异研究。在这些研究中，2项研究未字胃癌患者和对照组中发现菌属多样性差异，其中1项研究样本量较小（10名非贲门胃癌患者和5名消化不良对照）可能是难以检测组间微生物多样性差异的原因，然而，另一项由Wang等人开展的共纳入315位研究对象（212位慢性胃炎患者、103位胃癌患者）研究也未发现组间α多样性（Chao1和Shannon指数）存在差异。Shannon指数同时考虑了丰富度(观察到的类群数量)和均匀度(特定类群的相对丰富度)，而Chao1丰富度估计值仅考虑了给定样本的物种丰富度。虽然在胃癌和慢性胃炎患者中，这两个多样性指标在统计学上无差异，但Wang等人发现与慢性胃炎患者相比，胃癌患者的细菌载量增加，以每微克DNA的16S rRNA基因拷贝数来衡量的。这一结果说明胃酸过少导致的细菌载量增加在胃癌发展过程中起重要作用。
不同于上述两项研究，大部分研究发现了胃癌患者与对照组间胃部菌群多样性存在差异。然而，关于疾病进展和胃部菌群多样性之间的关系尚不清楚。一般说来，所有针对这一问题的研究都是通过在胃镜检查中收集的胃活检组织标本进行高通量测序来分析包括健康到胃癌患者的胃部菌群。部分研究在纳入胃癌患者之外还纳入了胃炎（萎缩性或其他慢性胃炎）或肠上皮化生患者。大多数研究具有相似的研究对象排除标准，包括样品采集前2-6个月内未使用PPI、H2抑制剂、抗炎药或抗生素。Aviles-Jimenez等人通过检测患有浅表性胃炎（5位）、IM（5位）和GC（5位）的组织标本来研究胃部菌群变化，该研究发现随着疾病进展过程，胃部菌群多样性（菌属水平）逐渐降低。一项来自中国的队列研究纳入21位浅表性胃炎患者，23位AG患者，17位IM患者和20位GC患者，该研究发现与浅表性胃炎相比，患有IM和GC的研究对象的菌群多样性较低。另外一项纳入81位研象对象的葡萄牙研究发现与患有慢性胃炎的患者相比，胃癌患者的胃部菌群多样性明显较低。除此之外，在一项纳入11位研究对象的中国研究中， Hu等人发现与慢性胃炎患者相比，胃癌患者的胃部菌群多样性较低。值得注意的是，尽管样本量很小，但该研究是唯一一项利用宏基因组测序来检测胃部菌群的研究。此外，本研究采用胃脱落细胞标本而非活检组织样本进行分析。
然而，有研究表明胃癌缓和胃部菌群多样性较高。虽然具有相似的研究对象排除标本，但是一项纳入31位慢性胃炎、IM和GC研究对象的来自韩国的研究发现胃癌患者的胃部菌群均匀度和丰富度均高于其他两组对象。一项纳入32位中国研究对象（12位胃癌患者，20位功能性消化不良患者）的研究得到相似结果，该研究表明与消化不良的研究对象相比，胃癌患者的菌群丰富度和多样性较高。
上述所有研究都比较了胃癌患者与患有其他胃部疾病患者的胃部菌群多样性。近期，Liu等人研究276例患者特定胃部菌群多样性和丰富度与胃癌发生的关系。通过检测胃癌患者的正常、癌旁和癌组织，研究人员发现与正常胃组织相比，胃癌和癌旁组织的菌群多样性和丰富性降低。这一发现表明胃部菌群的丰富度不仅在萎缩性胃炎到胃癌的进展过程中存在差异，而且在同一胃癌患者的不同部位微生态环境不同。
目前，胃部菌群多样性与胃癌进展过程是否存在相关性尚不清楚。虽然一些研究使用了相似的数据收集方法、排除标准、高通量测序技术以及多样性指标(Shannon或Chao1指数)，但目前对于胃微生态多样性与胃癌的关系还未达成共识。从机制角度，菌群多样性的升高或降低都可能与胃癌进展过程相关。虽然在90%以上的急性胃炎患者的胃组织中发现了Hp感染，但是在大多数AG、IM和GC患者的胃组织中未发现Hp感染，即使其血清学检查显示阳性。该结果说明Hp感染可能在胃癌发展的后期消失（表-1）。Hp感染阴性和泌酸减少可能促进其他微生物在胃中定植。Hp感染可能会导致AG发生和胃内pH升高，进而导致胃内定植菌增多，微生态环境复杂（表-1）。然而，也可能的是，与Hp感染相关的炎症将产生不适宜大多数微生物生存的胃环境，从而导致本来微生物较少的胃部微生态环境更加受限。除此之外，这些研究还需考虑的另一个因素是，上述中国、瑞典、墨西哥、葡萄牙和马来西亚的研究所纳入的研究对象的种族是较为相同的，然而，各项研究仅纳入来自单一民族的研究对象进。众所周知，饮食习惯是影响胃部菌群的重要因素之一，目前尚不清楚种族因素如何影响健康人的胃部微生态环境，更不用说胃部菌群在胃癌进展过程中的潜在影响了。因此，开展大规模、多中心、多种族的关注从正常到胃癌进展过程中个体胃微生态变化过程的研究是极有必要的。
表-2 胃癌与胃部菌群多样性的相关研究
2 特定微生物在胃癌发生发展中的潜在作用
Hp感染引起的胃酸分泌障碍可能促进其他微生物在胃内定植，虽然微生物多样性与胃癌的相关性尚未达成共识，但已有多项研究表明特定的微生物与胃癌之间存在关联。例如，在几项研究中发现，与对照组相比，胃癌患者中乳杆菌属的比例更高。Castaño-Rodriguez等人发现与功能性消化不良患者相比，胃癌患者乳杆菌和乳球菌属的相对丰度更高。虽然该研究无法表明因果关系，但部分揭示微生物在胃癌患者中过度表达的潜在机制。乳球菌和乳杆菌属都可以产生乳酸，乳酸可以作为能量来源，理论上可以帮助肿瘤进展和侵袭。另一项研究表明，与对照组相比，Lachnospiracea在胃癌患者的相对丰度更高。其他研究表明，Lachnospiracea在炎症过程中相对丰度降低，揭示该菌门对炎症过程可能存在调节作用。除了乳球菌和乳杆菌比例增高，Wang等人发现Nitrospirae菌门存在于所有胃癌患者中，但是未在慢性胃炎患者中发现。值得注意的是，Nitrospirae菌门在硝酸盐和亚硝酸盐的新陈代谢过程中发挥作用，而硝酸盐是与胃癌进展相关的重要危险因素之一，此外，也可能生成致癌物N-亚硝基化合物。Fusobacterium，Veillonella，Leptotrichia，Haemophilus和Campylobacter等常见口腔定植菌在胃癌患者中相对丰度也较高。特别是Fusobacterium菌属，该菌属是一种促炎性口腔菌属，曾因其在结肠癌和乳腺癌发生中的潜在作用而备受关注。有趣的是，与结直肠癌有关的牛链球菌在胃癌患者中的比例也有所增加，但这一发现在其他研究中没有重复。此外，皮肤菌群Propionibacterium acnes在胃癌组织中相对丰度较高，据推测，其产生的短链脂肪酸可能与淋巴细胞性胃炎有关。
一项研究证明与浅表性胃炎患者相比， Sphingobium yanoikuyae在胃癌患者中丰度降低，而该菌群能够降解芳香烃——一种具有潜在致癌作用的分子。同时该研究首次揭示Sphingobium yanoikuyae与胃癌之间存在负相关。Park等人在2019年发现与慢性浅表性胃炎患者相比，Rhiozobiales 在肠上皮化生患者中相对丰度增加。此外，该研究发现基因编码IV型分泌系统（T4SS）蛋白在肠上皮化生患者中丰度增加。T4SS是微生物用来运输大分子穿过细胞膜的一种分泌系统。许多致病菌使用T4SS来转移被称为毒力因子的蛋白质，这些蛋白质赋予细菌致病性。虽然研究人员没有发现Rhizobiales和Hp之间存在水平遗传转移的直接证据，但他们假设T4SS基因可能在Hp和其他微生物间存在转移，从而促进了Hp的致癌性。
3 转基因小鼠胃癌模型
前面提到的几项研究表明，胃微生态环境与胃癌的发生有关。甚至对某些微生物在胃癌发生、发展过程中的潜在作用也给出合理的解释。虽然上述研究未阐明因果关系，但最近基于转基因小鼠模型的研究进一步阐明了胃微生态环境与胃癌的关系。胰岛素-胃泌素转基因(INS-GAS)小鼠模型具有较高的循环胃泌素水平，并持续促进胃酸生成，导致萎缩性胃炎。此外， 80%的转基因小鼠在感染Hp后6个月内即可发展为胃肠道肿瘤，高于人类感染Hp后进展为肿瘤的比例。利用INS-GAS小鼠模型，几项研究尝试揭示微生物与胃癌发展之间的因果关系。（表-3）
2008年，第一项基于转基因小鼠模型的研究表明微生物与胃癌间存在关联。Lee等人在用三联疗法(甲硝唑、奥美拉唑、克拉霉素)治疗INS-GAS小鼠后发现，在这些小鼠中根除Hp可以降低感染几周后小鼠胃不典型增生的严重程度。更为有趣的是，他们在用三联疗法治疗未感染Hp的INS-GAS小鼠后发现相似结果。该研究揭示抗生素治疗对Hp以外的微生物具有潜在作用。鉴于这项研究仅关注在根除Hp在胃癌发展中的作用，未观察经三联疗法治疗后微生物多样性或特定微生物丰度的变化。
其他研究也利用INS-GAS小鼠模型来探索胃微生物与胃癌之间的联系。特别的是，有研究尝试在INS-GAS小鼠模型中证明微生物如何影响胃癌的发展。通过操纵转基因小鼠模型，Lofgren等人发现，在感染Hp11个月后，与INS-GAS小鼠相比，无菌INS-GAS小鼠的胃部病变减少且微生态环境更复杂。为深入探索上述结果，Lertpiriyapong等人评估多样化菌群的存在是否是胃部疾病进展的必要条件。为此，研究人员比较了三组（复杂型、无菌型和局限型）具有不同微生物组成的INS-GAS小鼠在感染后发生胃癌的风险。该研究发现菌群构成局限组与复杂组的小鼠中发展为胃癌的比例相似，但是与无菌小鼠相比，菌群构成局限组小鼠发生胃炎、上皮缺损、泌氧腺萎缩、上皮增生和异型增生的情况显著增加。综上所述，Hp可以与其他微生物协同作用，促进胃癌的发生。在感染Hp后，其他微生物可能在胃癌的发生发展中起一定作用，但不一定是胃癌发生的必要条件。既往研究推测Hp感染引起的胃萎缩所致的贲门失弛缓症，可能除了引起下消化道细菌定植外，还可能导致共生细菌的过度生长，且这种过度生长的细菌可能在胃癌的发生发展中起一定作用。然而，在INS-GAS小鼠模型中，似乎只有有限和复杂的微生物构成具有相似的可能性导致胃癌的发生。
除了表明在Hp感染后，胃其他微生物对胃癌的发展起作用外，基于INS-GAS小鼠模型的研究还可为胃部疾病进展过程中个体的潜在治疗干预提供线索。例如，研究人员发现与单独感染Hp的INS-GAS小鼠相比，混合感染的INS-GAS小鼠具有较低可能性发生Hp相关性胃萎缩和异型增生并且更不容易在肠道菌群较不丰富的INS-GAS小鼠中定植。研究人员假设，这一发现是由于蠕虫诱导Th2相关炎症反应上调，并增加了调节性T细胞向胃的聚集，从而保持了壁细胞功能，维持正常pH。本研究提示，由其他致病菌引起的免疫调节反应可能是预防Hp相关性胃炎向胃癌进展的一种潜在治疗方式，值得进一步研究。
表-3 基于INS-GAS小鼠模型的微生态与胃癌研究
4 讨论
近年来，随着科研人员和临床医生探索菌群在传染病、癌症、呼吸系统疾病、代谢性疾病和自身免疫性疾病等疾病过程中作用的兴起，对人体微生态环境的关注逐渐增加。然而，由于胃的酸性条件和以往培养技术的局限性，从前胃部微生物的研究具有巨大挑战性。随着新PCR技术和宏基因组的出现，胃微生物的研究在过去十年内显著增加。
到目前为止，大多数研究表明，在从健康发展到胃癌的过程中，胃微生物发生了变化。然而，尽管似乎有一个普遍的共识，即胃癌患者的微生物与对照组相比存在差异，但迄今为止，所存在的差异是多样性增加还是减少，尚不明确。虽然大多数研究在分析时使用了相同的物种多样性衡量标准(Chao1或Shannon指数)，但数据收集和测序技术等方面有所不同。目前还不清楚这是否影响了基因组构建和随后的微生物物种鉴定。测序技术方面的差异可以部分解释不同研究之间物种多样性发现的差异。胃微生物与胃癌进展研究的一个主要局限性是这些研究都是回顾性且相互关联的。由于胃癌的发展需要几十年的持续时间，在整个过程中跟踪相同的人是不可行的。所有研究均采用横断面研究设计，在某个时间点评估不同类型患者的菌群多样性。因此，需要进行纵向和前瞻性研究来评估肠道菌群随时间的变化。但是这些研究的可行性较差，因为只有3%的感染Hp的人可能发展为胃癌。既往研究在没有确定任何个体的胃微生物基线组成的情况下，已经将不同阶段的胃病患者的微生物相互比较。而在这些研究中，无法解释饮食、疾病史或种族差异对患者胃微生物的影响。此外，疾病的治疗方式或患者后期的生活方式的改变也可能影响胃微生物。因此，难以在胃微生物和胃癌之间建立任何形式的因果联系。不过收集有关治疗和饮食的资料可能有助于控制混杂因素。
虽然关于胃微生物在胃癌发展过程中的作用仍然没有被证明因果关系，但基于INS-GAS小鼠模型的研究有助于阐明胃微生物在胃癌发展中的作用。Hp感染后其他胃部微生物的存在加速了胃癌的发展，但可能只有有限的微生物才能实现如此效果。应该开展Lertpiriyapong等人研究的重新实验以确认只有有限的胃微生物是加速INS-GAS小鼠胃癌发展所必需的。此外，关于免疫调节在防止胃病进展中的作用的进一步研究也是极有必要的，因为INS-GAS小鼠模型表明，其他病原体(如蠕虫)的混合感染可通过上调调节性T细胞而起到保护作用。特别是宏基因组学研究可确定参与这一过程的微生物的基因家族。此外，虽然还没有发现Hp感染后发生胃癌所必需的单个微生物，但多项研究在胃癌患者中发现了几种丰度增加的微生物。这些菌属可能有促进肿瘤发展的机制，包括引发炎症、为肿瘤生长提供能量或产生致癌的N-亚硝基化合物。而其他看似具有保护作用的菌属在胃癌患者中减少，例如Sphingobium Yanoikuyae。鉴于与人体相比，在INS-GAS小鼠模型中操纵微生物可行性更高，因此会开展进一步研究。
未来应该开展大规模、多中心、前瞻性研究，确定胃癌相关的特异性微生物以及胃癌进展过程中微生物的动态变化。随着胃微生物研究的增加，微生物的变化有可能被成为预测疾病进展的标志物。此外，类似于根除Hp, 可以通过操纵其他胃部微生物进行治疗从而降低发展为胃癌的风险。
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