科研 | Nature 子刊: 小鼠肠道微生物生物库扩大了培养细菌的覆盖范围(国人作品)
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道微生物组（GM）的研究中常常使用小鼠作为实验模型，但大多数小鼠GM成员仍未被鉴定。本文中，研究者构建了迄今为止最大的小鼠肠道微生物生物库（mGMB），并对其中77种潜在的新物种进行了测序、表型鉴定和命名。同时研究者还对mGMB中菌种的多样性、流行率以及GM功能覆盖率等进行了分析。本研究中mGMB收集的微生物和基因组数据扩大了小鼠GM的分类学特征，并为研究宿主与微生物的相互作用以及与宿主健康、疾病相关的GM功能提供了有用的资源。
论文ID
原名：The Mouse Gut Microbial Biobank expands thecoverage of cultured bacteria
译名：小鼠肠道微生物生物库扩大了培养细菌的覆盖范围
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.1.7
通讯作者：刘双江&刘宏伟
作者单位：中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室&中国科学院大学，中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室
实验设计
结果
1. 细菌分离株揭示了先前未培养的分类群
小鼠肠道微生物的大规模培养和鉴定是按照简单流程进行的，且每个步骤的结果都展示在补充图1的红色虚线框中。简而言之，在前三个步骤后，研究者将获得的1831个分离株分成了154个分类群，这是根据16S rRNA基因特性以及将不同分类群的临界值控制为98%进行分类的。如补充图2所示，在154个分类群中，只有51个与先前描述的物种（白色背景）相匹配。而其它103个分类群并不能与任何已知物种（浅蓝色背景）相匹配，表明它们代表了潜在的新型分类群。接着对1831个分离株接种进行大规模培养，但其中394个分离株在进一步培养中并不能增殖。其余的1437个分离株属于126个不同的分类群。每个分离株的特征和16S rRNA基因序列都记录在了补充数据1中。在菌株冷冻保存后，研究者获得了244株分离株，代表了126个可培养的分类群，可供公众使用。然后对126个可培养分类群的草图基因组进行了测序，这些数据可以通过NCBI、gcMeta和NODE等公共数据库进行获取。在补充图3中基于KO功能距离，展示了所有的126个可培养分类群的功能多样性。根据NCBI的16S核糖体RNA序列数据库中已知物种的16S rRNA序列特征（更新日期：2019/07/08，序列数目：20767），这126个分类群中有77个是潜在的新型分类群。最近发表了两篇关于可培养人类肠道微生物基因组的文章，而本文正处于评审中时，研究者将这77个分类群的16S rRNA序列与先前发表的四个不同研究中人类肠道微生物基因组集合进行了比较，进一步验证了这77个分类群的新颖性。结果显示，77个分类群中有3个分类群（分类单元55、分类单元72和分类单元149）与最新发表的两项研究中分离株的16S rRNA序列比对鉴定相似性大于98%，这表明这3个分类群在先前的研究中已进行了培养和测序。但是，先前研究中只报道了这三个分类群的基因组，并没有报道其形态、生理和生化特征。在本项工作中，这77个分类群进行了以下多相表征：（1）系统发育分析，（2）形态学观察，（3）通过BIOLOG测试的生物性状检验法，以及（4）基因组分析/比较。结果，研究者鉴定了77个新物种，识别了43个新菌属。补充数据2和补充图5-81中提供了这77个分类群的详细描述及它们的建议术语，其中还包括它们的系统发育、形态学和其它表型特征。通过努力，研究者构建了迄今为止最大的mGMB，它包含244种菌株，分别代表来自80个属、28个科、5个门的126个菌种，并已在中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）保存，供公众使用，而且126个菌种的草图基因组也可以公开访问（补充数据3）。
2 mGMB扩大了现有菌藏的多样性
第一个小鼠肠道细菌库（miBC）包含76种可培养的细菌物种。正如分类进化分枝图所示（图1a），mGMB的构建极大扩展了可培养小鼠肠道微生物的资源库，其将物种数从76种增加到180种，菌属数从48种增加至110种。mGMB和miBC重叠包含了22个细菌物种。构建的mGMB独自贡献了104个独特物种，包含77个新物种和43个新属。如图1b所示，miBC的76个物种在物种水平上单独覆盖了miBC研究中所使用的93个样本中16S rRNA基因扩增子总片段的18.37±1.55%（平均值±SEM）（16S rRNA基因相似性>97%），而mGMB的126个物种包含了总片段数的42.20±1.29%。两个资源库共同拥有16.11±1.58%的片段。这两个资源库在物种水平上共同覆盖了总片段的44.29±1.40%，其中miBC和mGMB分别贡献了总片段的2.27±0.47%和25.92±1.12%。
图1. mGMB的分类学多样性及其对小鼠肠道微生物资源收集的贡献
a. 进化分支图显示了mGMB和miBC中细菌的分类学多样性。mGMB和miBC合起来共有180个细菌物种，属于110个属、33个科和5个门。背景根据门进行颜色标记。mGMB中所有的104个物种均标有星号，其中77个新物种用红色星号表示。专一代表mGMB全部成员的62个属用五边形符号表示，其中43个新鉴定的属用红色五边形符号表示。mGMB特有的五个科用正方形符合表示。mGMB中126个物种由第一级的紫色外环表示（图a中标记为mGMB）。miBC中76个物种由第二级绿色外环表示（图a中标记为miBC）。而mGMB和miBC共同拥有的22个物种由第三级黄色外环表示（图a中标记为共同拥有）。b.韦恩图显示在物种水平上，mGMB和miBC对来自miBC研究中小鼠样本（n=93）的16S rRNA基因扩增子数据集的片段覆盖率（序列相似性>97%）。miBC-特异性（2.27±0.47%）：miBC专一涵盖的片段比例；mGMB-特异性（25.92±1.12%）：mGMB专一涵盖的片段比例；共有的（16.11±1.58%）：两个资源库的共同拥有的片段比例。覆盖率表示为平均值±SEM。原始数据由源文件提供。
3 mGMB中的77个新物种在小鼠肠道中很普遍
mGMB中的77个新型细菌物种起源于一个当地供应商处购买的特定基因型小鼠（ob/ob C57BL/6J）。为了评估这些新分类群在小鼠肠道中的分布范围，研究者利用了本研究和先前研究（补充数据4）中公开可用的小鼠肠道微生物基因谱（GMs）16S rRNA基因扩增子数据库。总共从NCBI SRA数据库中收集了来自六个研究的740个小鼠样品的16S rRNA基因扩增子数据，并从中挖掘出了这些新的分类群。如图2a所示，从野生型C57BL/6J（77个分类群中的第69~72个）、CD1（77个分类群中的第74个）和来自miBC研究中的各种背景小鼠（77个分类群中的第66个）的样品中鉴定出新的分类群，但并没有在ob/ob小鼠（77个分类群中的第72~76个）鉴定到。图2a和补充数据4显示，这些新的细菌类群在来自不同供应商的小鼠以及高脂饮食或药物治疗引起的肥胖小鼠中也很普遍。考虑到这些新型分类群在小鼠GMs中的普遍性，研究者使用77个新分类群菌株的16S rRNA基因序列升级了LTP数据库（版本132）（升级后命名为LTP版本-mGMB），并重新注释了补充数据4中罗列的扩增子数据集，从而升级了数据库LTP version-mGMB。结果，序列数据集的注释率在属水平上（序列相似性>95%）从总片段的33.43±9.52%显著提高到49.46±9.54%，而在物种水平上（序列相似性>97%）从12.98±5.07%提高到24.37±6.60%（图2b，c）。有趣的是，研究者观察到77个新分类群中的第25种和第39种与美国和澳大利亚的研究中的人类GMs相似。研究者还发现，在人类口腔和阴道微生物群中并未鉴定出这77种新的分类群，表明这些新的分类群可能是肠道适应性的细菌种群。
图2. 基于16S rRNA基因扩增子的mGMB中新物种的流行率分析。
a．雷达图描绘了来自不同宿主且与宿主相关的微生物群中77个新分类群的流行情况。数据集中相似OUTs的新物种数目标记为橙色。OB.CAN：来自中国的ob/ob小鼠肠道微生物群（n=12）；WT.CAN：来自中国的C57BL/6J小鼠肠道微生物群（n=12）；OB.DEN：来自丹麦的ob/ob小鼠肠道微生物群（n=239）；WT.DEN：来自丹麦的C57BL/6J小鼠肠道微生物群（n=120）；OB.tre：来自中国且使用抗代谢综合征药物处理SA-7处理的ob/ob小鼠肠道微生物群（n=31）；DIO.USA：来自美国且通过饮食引起肥胖症的小鼠肠道微生物群（n=25）；CD1.USA：来自美国且远系繁殖的CD1小鼠肠道微生物群（n=208）；miBC：来自miBC拥有不同遗传背景且在欧美地区被饲养过的小鼠肠道微生物群（n=93）；HG.AUS：来自澳大利亚的小鼠肠道微生物群（n=300）；HG.USA：来自美国的人类肠道微生物群（n=97）；MG：来自中国的恒河猴肠道微生物群（n=160）；HV：人类阴道微生物群（n=20）；HO：人类口腔微生物群（n=66）。b，c 新型分类群分别在属水平上（b）和物种水平上（c）提高了小鼠GMs的16S rRNA基因扩增子数据的注释率。LTP 版本-132（草绿色）：使用LTP数据库版本-132来注释数据；LTP 版本-mGMB（浅黄色）：使用通过添加77种新型物种的16S rRNA基因序列而定制的LTP数据库来注释数据。数据使用盒式图表示；中心线：中位数；盒子的边线：四分位数；触须线：Tukey极值。图中给出了使用不同数据库注释率的平均值±SEM，并通过t检验统计分析确定为显著不同（p<0.001）。n的数目代表生物学独立样品。原始数据通过源文件提供。
4 mGMB很大程度上定义了肠道核心-和泛微生物群
除了77种新的细菌物种外，本研究还培养了另外49种先前已有报道的细菌物种，并将其收集在mGMB中。利用mGMB中全部126个物种，研究者试图确定mGMB对小鼠潜在的肠道核心和泛微生物群的覆盖率。为此，研究者从NCBI SRA数据库收集了ob/ob小鼠GMs（n=274）中可利用的16S rRNA基因扩增子原始数据，并对这些数据进行了综合分析，正如“方法”部分所述。如果研究者将核心菌属定义为FO（发生频率）>80%且RA（相对丰度）>0.1%，而泛菌属定义为FO（发生频率）>5%，那么在ob/ob小鼠的GMs中分别有36个和80个核心和泛菌属被鉴定出来，它们来自274个分析样本中总共129个注释属。在所有注释片段中，泛菌属平均覆盖99.8±0.2%，而核心菌属平均覆盖92.3±0.3%。如图3a所示，对于ob/ob小鼠，mGMB包含了40个核心菌属中的35个，90个泛菌属中的68个。核心-和泛菌属中mGMB的覆盖率分别达到88%和75%。
图3. mGMB定义了小鼠肠道微生物群中的核心-和泛微生物群。
a. ob/ob 小鼠的核心-和泛菌属分别在mGMB中的覆盖率。b.不同背景小鼠的核心-和泛菌属分别在mGMB中的覆盖率。条形图显示了分析的样本中每个属的发生频率（FO）（定义：当某一个属在所有样本中都存在时，定义为FO=100%；当某一个属在所有样本中都不存在时，定义为FO=0。），其中（a）图中n=274，（b）图中n=93。盒式图展示了每一个分类群的相对丰度（RA）；中心线：中位数；盒子的边线：四分位数；触须线：Tukey极值。RA用百分比的对数表示。核心菌属：FO>80%的菌属且平均RA>0.1%（log10（RA）>-3）；泛菌属：FO>5%的菌属。核心-和泛菌属的临界值在面板中用垂直虚线标记。紫色/蓝色：mGMB涵盖的菌属；米色：mGMB没有涵盖的菌属；紫色三角形标记：ob/ob小鼠和不同背景小鼠的核心菌属。n的数目代表生物学独立样本。原始数据通过源文件提供。
其次，为了确定mGMB是否广泛地代表不同背景小鼠的GMs，研究者探索了miBC中报道的不同背景小鼠的核心-和泛菌属。通过使用上述的核心-和泛菌属的定义方式，对于miBC中描述的不同研究背景小鼠，其中有74个菌属被鉴定为泛菌属，28个菌属被鉴定为核心菌属（图3b）。正如图3b中所示，mGMB包含28个核心菌属中的26个，74个泛菌属中的56个。覆盖率分别达到93%和76%。此外，在28个核心菌属中，有18个也是ob/ob小鼠的核心菌属，并且这18个共享的核心菌属都被mGMB覆盖了。以上结果清楚地表明，mGMB对ob/ob小鼠和不同背景小鼠均具有良好的覆盖率。
5 mGMB涵盖了小鼠GMs的大多数功能
为了评估mGMB对小鼠肠道微生物组的功能覆盖率，研究者整合了mGMB中的126个草图基因组，并对ob/ob小鼠（OB，n=6）和野生型小鼠（WT，n=6）的盲肠样品进行宏基因组测序。mGMB泛基因组是通过合并mGMB中126个草图基因组而产生的。对于OB和WT小鼠的盲肠样品，分别获得了54.5和50.6gB宏基因组准确数据。接着，将经过质量过滤的OB和WT样本的宏基因组片段映射到mGMB泛基因组中，并使用Anvi’o可视化映射图谱（图4a）。mGMB泛基因组的总长度为548Mb，其中mGMB泛基因组的DNA序列中超过80.1%可以映射到来自WT或OB的宏基因组片段（图4a中最外层的黄色层）。使用SAMtools对映射结果进行分析表明，平均而言，来自OB和WT的宏基因组片段分别有24.9±3.3%和24.0±1.9%映射到mGMB泛基因组。如方法中所述，进一步组装OB和WT样本（n=12）的宏基因组片段，从而预测开放阅读框以及随后进行非冗余独特基因目录的提取。为了证明在基因水平上126个草图基因组覆盖到了宏基因组上，研究者针对mGMB泛基因组进行了非冗余性宏基因组基因的BLASTp。结果显示，当氨基酸序列同源性的临界值分别设为60%和40%时，mGMB基因组分别覆盖了目录中52%和72%的独特基因。
图4. mGMB涵盖的宏基因组功能和与小鼠表型相关的GM特征。
a.OB和WT的宏基因组短片段对mGMB泛基因组的映射谱。OB：ob/ob小鼠GMs的宏基因组（n=6）；WT：C57BL/6J小鼠GMs的宏基因组（n=6）。Anvi’o树展示了mGMB泛基因组的分层聚类。WT层a~f代表了WT中每个分割层的检测；OB层a~f代表了OB中每个分割层的检测。最外层的黄色层显示了泛基因组片段映射到宏基因组片段的部分；最外层的蓝色层显示了泛基因组片段没有映射到宏基因组片段的部分。b.从mGMB中随机选择的基因组基于KO的小鼠肠道微生物组覆盖率。OB：ob/ob小鼠GMs宏基因组的KEGG同源基因（KO）库（n=6）;WT：C57BL/6J小鼠GMs宏基因组的KO库（n=6）；OB-特异性：KOs特异性出现在OB中；WT-特异性：KOs特异性出现在WT中；iMGMC基因目录：包含460万个独特基因和660个高质量宏基因组的组装基因组的整合型小鼠肠道宏基因组目录（iMGMC）。数据使用盒式图展示；中心线：中位数；箱形的边界：极值。c.与野生型（C57BL/6J）小鼠和代谢综合征（ob/ob C57BL/6J）小鼠相关且在属水平上的肠道菌群特征。OB：先前细菌分离使用的ob/ob小鼠盲肠样本（n=12）的16S rRNA基因扩增子；WT：对应的野生型C57BL/6J小鼠（n=12）的16S rRNA基因扩增子。数据使用盒式图展示；中心线：中位数；盒子的边线：四分位数；触须线：Tukey极值。两组数据之间的统计学比较分析使用t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；紫色：OB中富集；蓝色：WT中富集；薄荷绿背景：专一性出现在OB或WT组的菌属；米色背景：在两组中都出现的菌属但在RA方面具有显著差异；灰色菌属名字：在mGMB中并未恢复的菌属。n的数目代表生物学独立样本。P值在源数据文件中提供。
为了进一步研究已知GM功能的mGMB代表性，OB和WT样本（n=12）的非冗余宏基因组基因和mGMB基因组根据KO（KEGG同源性分析）数据库进行注释。平均而言，宏基因组基因的34.64±0.34%被注释到已知的KOs中。对于每个草图基因组以及OB和WT宏基因组，KOs的二进制代码（0/1）存在/不存在的资料生成了。通过从mGMB中基因组的随机递增选择算法进行KO谱（补充数据5）的累积分析。如图4b所示，OB和WT的平均覆盖量达到80%，且当样本数量增加到16时，覆盖率接近饱和，这表明来自mGMB的最适合的16个基因组可能很好地代表小鼠GMs的功能性。最终，126个草图基因组分别覆盖WT和OB小鼠中基于KO功能的93%和95%。除了本研究中的宏基因组数据外，研究者还重新研究了最大的整合型小鼠肠道宏基因组目录（iMGMC）,其保护了460万个独特基因和660个高质量的宏基因组组装的基因组。针对iMGMC进行相似的累积分析。如图4b（灰色框）所示，126个mGMB的草图基因组覆盖了iMGMC基于KO功能的59%。
6 GM特征与小鼠表型有关
对于OB小鼠（具有代谢综合征相关表型的ob/ob C57BL/6J）和WT小鼠（C57BL/6J）的肠道宏基因组分别有3455个和3521个KOs（补充数据5）被注释。统计数据表明，尽管来自OB和WT的两个KO库共同拥有其中3368个KOs，但两组的组成仍存在显著差异（P=0.003）。WT和OB小鼠中仍分别有153个和86个独特存在的KOs，且两组共同拥有的3368个KOs中有352个和250个分别在OB和WT小鼠中富集存在。正如图4b所示，mGMB对OB-特异性功能的代表性（93%）好于对WT-特异性功能的代表性（80%）。根据这些功能特征，研究者进一步探讨了mGMB中细菌成员如何在生物分类学的水平上反映潜在的肠道菌群特征。
结果
这项工作旨在构建一个小鼠肠道微生物的生物数据库（在本研究中称为mGMB），以供学术界和医学界公开使用，并促进实验性小鼠模型中GMs的培养依赖性研究。为了实现此目标，研究者就ob/ob C57BL/6J小鼠的细菌分离和培养进行了广泛而费力的研究。利用内部平台进行肠道微生物的分离、培养和分类学表征，研究者获得了1437个可培养的细菌分离株，其中包括126个不同物种。根据作者的自身经验，经过冷冻保存后（无论是冷冻干燥保存还是甘油保存），很多可培养的肠道微生物物种都很难恢复活性，尤其是生长缓慢的肠道微生物。研究者认为细菌细胞的生理状态以及冻干的程序都对细菌的生存力具有很大影响，但研究者尚未确定准确的关键因素。为了确保菌种在CGMCC中保存后的细胞活力，作者在本研究中采取了冗余保存策略，即每个细菌种类保存多达5个重复样品。最终，包含244个细菌的细胞群、代表126个不同物种的mGMB被成功存放到CGMCC中以供公众使用，且它们的基因组可在各种公共数据库（NCBI、NODE和gcMeta）中获取。与小鼠肠道微生物组相关研究相反的是，许多人类肠道微生物进行了大规模培养。不幸的是，这些可培养的肠道微生物中仅有一小部分得到了进一步的分类学表征和命名。大多数肠道微生物在分类学上仍未被定义和命名，且NCBI或EzBioCloud数据库中也没有代表这些微生物的16S rRNA基因序列。结果，这些曾经培养过的微生物会在随后的研究中再次培养并命名为新的微生物。因此，在这项研究中，研究者提出了一种简化的方案，根据国际细菌学命名法对这77个新型物种进行了分类学表征及命名建议。尽管这项研究显著增加了小鼠肠道微生物中可培养微生物的储量，但仍需要其他工作来进一步提高GMs的可培养性。虽然在最初的96孔板中检测到38个分类单元，但是当研究者试图将其转接到相同培养基中进行大规模培养时，它们并未繁殖。基于来自BIOLOG测试的结果，研究者发现四种碳源（即L-鼠李糖、D-果糖、D-半乳糖醛酸和D-氨基葡萄糖酸）支持mGMB中所有77个新菌种的生长。因此，这些碳源的提供可能促进先前研究中不可培养肠道微生物的恢复。
77个新菌种及其基因组资源对微生物与宿主互作的因果关系研究以及对宏基因组数据的理解都十分具有价值。比如，（1）最近一项使用来自mGMB的细菌菌株P4的研究表明Parabacteroides distasonis通过调节琥珀酸盐的产生和次级胆汁酸的转化来改善宿主肥胖症；（2）研究者还通过添加77种新的分类群来扩展LTP数据库，并创建了一个定制的LTP-mGMB数据库。正如“结果”部分所描述的，小鼠GM数据的注释率在属水平上提高了~50%，在物种水平上提高到24%以上，而在没有定制的LTP版本- mGMB数据库之前，其在物种水平上的注释率仅有~12%，属水平上仅有33%。此外，这项研究提出了GM核心菌群和核心基因组的概念，它们主要是mGMB中已鉴定核心物种/菌属的代表：前16~20个基因组覆盖OB和WT小鼠在KO水平上基于KO宏基因组功能的80%以上，而整个126个基因组覆盖了95%以上。在基因水平上，当氨基酸序列同源性的临界值分别设为60%和40%（即40%是蛋白质结构分类数据库（SCOP）鉴定临界值，而60%是氨基酸序列同源性针对功能保守鉴定时的最小阈值）时，来自宏基因组的预测基因中超过52%和72%被mGMB基因组覆盖。相比之下，OB和WT的宏基因组数据中仅有20~30%的DNA序列片段映射到以mGMB中126个基因组为代表的泛基因组中。这种在核苷酸序列水平上的低覆盖率（20~30%）而在功能性KO水平上的高覆盖率（95%）提醒了研究者，即DNA序列的功能冗余在GMs中普遍存在。研究者基于功能注释的分析支持了上述陈述。实际上，包括GMs在内的微生物生态系统中的高功能冗余是防止暂时失调并从中恢复的一个行之有效的策略。
在本研究和以前的研究中，研究者发现ob/ob小鼠和野生型C57BL/6J小鼠共享许多肠道微生物分类群。研究者也在本文中鉴定了ob/ob小鼠和野生型C57BL/6J小鼠中GM的表型相关特征。先前关于独立培养的宏基因组学研究表明，与对照组相比，拥有代谢综合征的小鼠（ob/ob小鼠的遗传特征）体内肠道微生物群落多样性较少。除了组成上的多样性，研究者观察到物种的丰富性与ob/ob小鼠或野生型C57BL/6J小鼠有关。OB和WT组之间这些物种的丰富度差异可能暗示了表型相关或代谢综合征相关的特征。基于本研究的结果和以前的发现，即肠道微生物群落中关键分类群的定量比率变化可能导致宿主的代谢问题，研究者提议为了GM稳态而监测物种多样性和种群大小，这对宿主健康十分重要。小鼠模型的粪便移植研究已经证实了GM在维持宿主健康代谢中发挥着重要作用；然而，具体的微生物贡献者仍然不能确定。以上14种在ob/ob小鼠GM内种群数量减少的细菌物种可能是维持健康新陈代谢的潜在贡献者，同时它们也可能作为来自mGMB的细菌资源，用来配制特定的细菌移植制剂。研究者认为，mGMB中增加的细菌菌株数量可以证明其在宿主-微生物相互作用中扮演的角色。
评论
肠道微生物组作为一个复杂的生态系统，对宿主的健康至关重要。而小鼠是人类健康研究中最重要的动物模型，但目前人们对其肠道微生物组的了解十分有限，这极大地阻碍了肠道微生物与宿主互作或菌株特异性干预等相关研究的开展，因此迫切地需要从小鼠模型中广泛培养并鉴定肠道微生物。本研究为了解决这些问题，建立了一个小鼠肠道微生物生物库（mGMB），供学术界和医学界公开使用，这对小鼠肠道微生物组的相关研究具有极大地促进作用。
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