科研 丨 Ecology：氮和磷循环的交互促进了磷的吸收并解释了植物生长响应的协同效应
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
氮（N）和磷（P）通常共同限制植物的生长。植物可能使用一种元素来获得另一种元素（即用N交换P和P交换N），这可能解释了N、P添加的协同生长响应。
本研究调查了一个位于南非的66年的包括4个N添加水平和是否添加P的草地实验。本研究调查了66年来地上净初级生产力（ANPP）对N、P添加的响应。此外，本研究测试了磷酸酶活性和植物对P的吸收是否依赖N的有效性，反之亦然，非共生的固氮和植物对N的吸收是否依赖P的有效性。本研究发现，从1951-2017年，ANPP受N和P的协同限制，但是随着时间的推移ANPP对N和P添加的响应减弱。在2017年，N和P共同添加的处理较单独施N的处理，地上P库、丛枝菌根真菌rRNA操纵子相对丰度以及土壤有机P库随着N肥添加速率而增加。N添加增加了磷酸酶的活性，表明植物使用N从有机来源中获取P。相反地，地上N库和非共生的固氮在P的添加下没有发生显著改变。总而言之，本研究的结果表明用N交换P对植物协同生长有贡献。植物利用增加的N从有机来源中来调用和吸收P，导致P循环的增加并且使植物群落对外源养分输入的敏感性降低。后者能解释为什么协同共限制的现象随着时间的推移减弱，这在短期的养分添加实验中通常被忽略。
氮（N）和磷共同限制植物的生长。植物可能使用一种元素来获
论文ID
原名：Interactions of nitrogen and phosphorus cycling promote P acquisition and explain synergistic plant-growth responses
译名：氮和磷循环的交互作用促进了磷的吸收并且解释了植物生长响应的协同效应
期刊：Ecology
IF：4.7
发表时间：2020.5
通讯作者：Schleuss, P. M.
作者单位：拜罗伊特大学
实验设计
实验地点位于南非，KwaZulu-Natal，Ukulinga Research农场附近的地中海草地（29°24´E，30°25´S）。年平均降雨量为790mm，并且80%的降雨量发生在夏季（从10月到4月）。月平均最低和最高温度分别是8.8℃（7月）和26.4℃（2月）。土壤较浅（0.6-1m），具有粉质粘土结构（5%的砂，46%粉土，49%粘土），土壤属于中等酸性土（pH in H2O 5.5），在表层15cm土壤中总有机碳（TOC; 7.3 kg C/m2）和总氮（TN; 0.47 kg N/m2）含量较高。
长期的养分添加实验开始于1951年，自此之后每年进行N和P的添加。本研究取样包括4个N添加水平，每个N添加水平包括添加和不添加P，总共8个处理，每个处理三个重复（总共24个样方）。处理包括对照（N0P0，不添加任何养分），P添加处理（N0P9=8.9 g P m-2 yr-1），三个N添加处理不添加P（N7P0=7.1g N m-2 yr-1; N14P0=14.1 g N m-2yr-1；N21P0=21.2 g N m-2yr-1），以及三种NP联合添加处理（N7P9；N14P9；N21P9）。每年以石灰石硝酸铵（28%N）的形式提供N，以过磷酸钙（10.5%P）的形式提供P。所有的实验样方（9 Ⅹ 2.7m）随机的安排在一个区组设计中，样方之间的最小距离为1m。在2017年的冬天，通过在2.7m宽的样方中采集2.13m宽的条带来收获地上NPP（前几年也是采取同样的方式），每个样方总的取样面积为5.75m2。在2017年的2月份，本研究在每个样方中采集了表层15厘米的土壤，使用3.5 cm直径的土钻，取6钻混合成一份土壤样品。所有的土壤样品在室温条件下放在塑料袋中并且取样一周内立即转移到拜罗伊特大学。
对采集回来的土壤样品进行土壤含水量、土壤持水能力（WHC）、总有机碳（TOC）、总氮（TN）、总磷（TP）、总的可溶性氮（DN）、可溶性有机碳（DOC）、总有机磷（TOP）和非共生固氮的测定。根据German 等（2011）中提到的方法进行磷酸酶活性的测定。进行丛枝菌根真菌相对于整个真菌群落丰度的测定以及nifH（编码固氮酶）基因丰度的测定。
采用SigmaPlot 13 和R 3.3 进行统计分析。所有的统计检验在P<0.05时认为显著。在进行混合线性模型或者方差分析之前，会对数据进行正态性（Shapiro-Wilk test）和方差齐性（Levene test）检验。如果有必要，数据会进行log或者平方根转化然后再检验。本研究采用单因素方差分析，分别在各单独的年份和不同的施N水平下，分析单独施N或者联合NP添加对ANPP的影响。采用混合效应模型分析整个阶段（1951-2017）的N和P添加对ANPP总的影响，将年作为随机因子。此外，ANPP的数据被分成两个阶段（1，1951-1979；2，1994-2017）来研究ANPP的响应动态。Welch检验用来比较两个阶段的差异。
采用两因素的方差分析对如下三个方面进行检验：（1）N水平之间是否存在显著差异（N效应），（2）P水平之间是否存在显著差异（P效应），（3）在N水平中进行P添加是否存在显著差异（N Ⅹ P效应）。
为了确定N添加或者P添加对磷酸酶活性和非共生固氮的影响，本研究使用R中的nlme包进行线性混合模型分析。为此，根据N或者P添加水平对处理进行分组。分别选择“P添加”或者“N添加”作为随机因子，进而消除来自于P添加或者N添加的附加方差。
结果
1 地上净初级生产力
1951到2017年的地上NPP记录表明单独或者联合添加N和P增加了ANPP，并导致协同增长（图1a）。对照处理中地上NPP每年每平米的平均值为385g，在单独施P的处理中增加了18%。单独添加低、中、高剂量的氮使ANPP分别增加了17%、27%和22%，平均为22%。联合添加N和P，ANPP的增加最强，显著高于N或者P的所有单一添加处理。在N、P处理中，ANPP在低、中、高的氮添加剂量下分别增加了59%、73%和90%，相对于对照处理平均增加了67%（图1a）。联合N和P添加的ANPP的增加显著高于单独N和单独P添加引起的ANPP增加的总和。这种现象在所有的氮添加水平中都能观测到。联合N、P添加处理的ANPP与单独施N和单独施P的ANPP总和之间的差值在低、中、高的氮添加水平下分别是24%、28%和30%。
本研究发现，由于N和P的联合添加，协同效应随着时间的推移而减少，正如低N和高N添加率的效应大小随时间变化的负线性关系所示。此外，本研究发现在实验的首个30年期间（1951-1979）较第二个实验阶段（1994-2017）的N、P共限制发生频率更高。因此，在大多数养分添加处理中，在试验的第二阶段，ANPP对养分添加的响应比显著降低（除了N0P9和N21P0，图1b）。在所有的N、P处理中随着时间的推移ANPP响应的降低是显而易见的；1994-2017阶段较1951-1979阶段，ANPP响应比在低、中、高N添加速率下分别平均减少了45%、35%和38%（图1b）。
在2017年，考虑所有的实验处理，ANPP的范围在267到442 g DM/m-2之间，在对照处理中ANPP的值最低。两因素的方差分析表明P添加有正的效应，但是多重比较发现处理间没有显著差异。此外，单独施N在2017年对ANPP没有影响（表1）。多元回归分析表明在2017年P添加和P酸酶活性是ANPP最好的预测因子。从模型中去除不显著的变量后，P添加解释了ANPP 25%的变异，P酸酶活性解释了13%的变异。相反地，N添加，DN含量以及非共生固N在三个模型中对ANPP都没有影响。
2 2017年地上N和P库以及含量
在元素添加处理中地上N库之间没有显著差异，但是当没有P添加时地上N库与N添加处理正相关。与对照相比，地上N含量在所有单独施N的处理中都显著高于对照（表1）。在没有P添加的N处理中，地上生物量中N含量与N添加速率显著相关。相反地，在NP处理中，在不同的N水平之间地上N含量没有显著差异（表1）并且与N添加速率不相关。相对于不添加P的N处理，在所有的NP处理中P的添加显著降低了地上N含量。
地上P库在所有接收P的处理中显著高于没有P添加的处理中的，并且当N与P联合添加，N添加越多地上P库更高。单独添加P显著增加了地上生物量中的P含量，然而单独施N（无论添加多少）没有改变地上生物量中的P含量（表1）。然而，当P与N一起添加时，地上P含量高于所有对应的单独施N的处理中的。最重要的是，当N和P联合添加时，地上P含量随着N添加速率的增加而增加。因此，与单独添加P相比，在NP处理中地上P含量在低、中、高的N速率下分别显著提高1.3、1.28和1.4倍。
3 土壤和土壤水提物中元素含量
然而土壤TOC和TN含量与N、P添加无关，但是土壤TP含量在P添加的处理中显著增加。DN含量随着施N速率增加，但是当N与P联合添加时DN增加的程度减弱。DOC的含量对N和P的添加响应较弱，并且仅仅在没有P添加的高N添加处理下DOC相对于对照显著增加。DIP含量在P添加的处理中显著高于不添加P的处理中的，并且当N和P联合添加时，DIP随着N添加速率的增加而增加。
4 土壤TOP含量
在对照中，土壤TOP含量为0.25 g Pkg/soil。单独施N没有改变TOP含量，不管添加量是多少。相对于不添加N的P处理，在NP处理中在低、中和高的N添加水平下TOP含量分别增加了2.2、1.7和2倍（图2a）。在所有的N添加处理中，P添加显著增加了TOP含量（图2b）。此外，相对于不添加N的P添加处理，N和P联合添加时，TOP含量随着N添加速率显著增加（图2a）。TOP含量与地上P含量（图2c）以及地上P库正相关（图2d）。
图2 总的土壤有机P（TOP）含量与（a）N添加，（b）P添加，（c）地上P含量和（d）地上P库之间的函数关系。
5 磷酸酶活性
在对照处理中磷酸酶的活性为114 nmol g soil-1h-1，并且在不添加P的高N水平添加下增加了8.1倍（表1）。不添加P时的低和高水平的N添加与对照没有显著差异。此外在所有NP处理中磷酸酶活性在不同的N添加水平之间没有差异（表1）。在没有N添加的处理中磷酸酶的活性值为146 nmol g soil-1h-1（图3a）。磷酸酶的活性随着N添加速率的增加而增加并且相对于不添加N的处理显著增加了4.4倍（图3a）。磷酸酶的活性随着P的添加而降低并且显著低于不添加P的处理中的（图3b）。
磷酸酶活性与DN含量呈显著的正相关关系，也说明N添加对磷酸酶活性有正向影响（图3c），并且log转化的DIP含量与磷酸酶活性负相关也支持P添加对磷酸酶活性有部分的负影响（图3d）。此外，本研究发现磷酸酶活性与DOC：DN的比值存在很强的联系。磷酸酶活性随着DOC：DN的比值的增加指数减少（图3e），并且随着log转化的DIN：DIP比值的增加而指数增加（图3f）。
6 非共生N2的固定
在没有N添加的处理中，非共生N2的固定速率为12.5 ng N g soil-1d-1，并且在低、中和高的N添加水平下分别减少了0.49、0.25和0.46倍。然而，N2的固定速率在相同的N添加水平中呈现很大的变异；仅仅只有中的N添加水平与添加N的参照N水平有显著差异（图4a）。本研究发现是否添加P对N2的固定没有显著影响（图4b）。在对照样方中非共生的N2的固定的平均值是12.4 ng N gsoil-1d-1（表1），这相当于土壤表层中（0-15 cm）每年每公顷添加6.6kg N。不添加P的N处理之间没有显著差异，在NP处理中，仅仅在中N水平添加下显著低于不加N加P处理的0.17倍（表1）。单因素相关分析表明非共生N2的固定速率与DN的含量负相关（图4c），然而独立于DIP的含量（图4d）。非共生N2的固定于DOC：DN的比值正相关（图4e）并且与log转化的DIP：DIN比值负相关（图4f）。
7 AMF和nifH基因丰度
在所有N水平下，丛枝菌根真菌科的Glomeraceae, Archaeosporales,Paraglomeraceae, Glomeromycetes, 和 Claroideoglomeraceae属的相对丰度在P添加的处理下显著高于不添加P的处理（表1），并且在NP处理中随着N添加速率的增加而增加。然而，AMF基因丰度在不添加P的施N处理中与N添加量无关。
固N酶铁蛋白（nifH）作为固N菌群落的标志物，其相对基因丰度随着施N量的增加而逐渐降低，但当N和P同时添加时，其反应较弱。在没有P添加的N处理中，nifH基因丰度在中和高的N添加水平下显著低于对照中的（表1）。在P添加的N处理中仅仅在高N水平下nifH与单独施P不施N中的不同。总而言之，两因素方差分析表明在各N水平上，添加P对nifH基因相对丰度的预测无显著变化（表1）。
讨论
1 N和P的协同限制
从1951到2017年，在N和P联合添加下的ANPP比单独N或者P添加下的更高，这表明ANPP受NP共同限制。由于NP联合添加，ANPP的增加比单独施N和单独施P下的ANPP之和还要高。因此，结果证明了一个协同的效应。本研究的发现在很大程度上与荟萃分析相一致，即植物对单一的，尤其是N和P的联合添加的反应增加（Elser et al.2007, Harpole et al. 2011）。Davidson 和Howarth （2007）指出Elser 等（2007）的数据分析主要源于短期实验，然而本研究证明的N和P对ANPP的共同限制是基于66年的草地实验。
引起ANPP协同响应的机理还知之甚少。本研究发现，在联合NP处理时，有机P库，P循环以及植物P吸收过程随着N添加水平而增加。本研究认为这些过程有助于协同生长响应。
2 N和P的添加控制着有机P的形成和循环
土壤TOP含量由于P的添加而增加，尤其是当P和N联合添加时。最合理的解释是，在66年的试验期间，NP处理下较高的植物生产力和较高的地上P浓度增加了土壤P库。本研究发现土壤TOP与地上P库存在很强的关系。类似地，在内蒙古草地中观测到N和P联合添加使得土壤中的TOP相对于对照增加了8%（Tian et al. 2016）。尽管有机P不能直接被植物利用，但是它与植物营养高度相关，并且大多数有机P可以通过磷酸酶水解从而变成可被利用的状态（Tiessen et al. 1994, Helfenstein et al. 2018）。这方面的证据来自于Richter 等（2006）的一项研究，他们证明了在次生林建立28年后表现出土壤有机P强烈的消耗，并且认为大多数的有机P已经被树木吸收。此外，Margalef 等（2019）指出土壤有机P库结合磷酸酶活性通常比直接测定有效P形态能更好的提供P的有效性指标。
本研究发现磷酸酶活性随着N的输入而增加。本研究的结果表明植物和微生物利用额外的N来产生和释放磷酸酶，从而从土壤有机P库中获得有效P。因此，在NP联合处理中，P从有机P库中的再循环能力强于仅仅P添加的处理中的。在NP处理中增加的磷酸酶活性和土壤TOP含量可能有助于植物P的吸收，因为两者的增加都增加了磷酸酶与有机P化合物相遇并催化其水解的可能性。因此，增加的有机P水解可能是解释ANPP协同生长响应的重要机理。与此一致的是，多元回归分析表明2017年38%的ANPP变异能够被磷酸酶活性（解释13%）和P添加（解释25%）解释。最有可能的是，添加N可以让植物和微生物合成消耗N的磷酸酶，进而提供有效的OP供植物吸收。此外，本研究发现P添加降低了磷酸酶活性。这一现象最可能的原因是一旦有P的需求时，植物和微生物下调磷酸酶的活性，（Marklein and Houlton 2012, Huuck et al. 2018）。
3 N和P的交互作用对植物P吸收的影响
在所有的NP处理中，当地上P库与N添加速率正相关时，土壤DIP含量随着N添加速率降低。这表明N添加刺激了植物对P的吸收（只要DIP足够有效）并且导致了土壤DIP的消耗。本研究的结果与Long 等（2016）的结果一致，他在内蒙古草地生态系统发现在NP联合添加的处理中9种不同的植物物种中的P含量显著高于单独P或者N添加中的。类似的，Deng 等（2017）发现在广泛的陆地生态系统中N添加增加了地上生物量中P的吸收。一些机制可以解释为什么植物P吸收得益于高N利用效率。首先，植物能利用N上调P吸收转运系统。因为植物细胞中的DIP含量高于土壤中的，所以植物利用质子-ATP酶在膜上进行磷酸盐的转运。N的添加能增加阴离子/H+共转运泵的活性，因为NH4+需要释放H+。其次，N和P的输入可能以增加植物营养的吸收的方式改变了根的性状特征。例如，硝酸盐和磷酸盐都是激发根系分枝的信号分子，这会引起小规模的土壤探索的加强。其他的研究也表明在N和P添加下根生物量会增加；例如，N和P对根系产量变化的荟萃分析表明在热带草地单独施N、单独施P以及联合施NP分别比对照提高了11%、31%和53%（Yuan and Chen 2012）。第三，N和P的添加对AMF的丰度和定殖有负或者正的影响。本研究发现，AMF基因的相对丰度随着N添加速率而增加，当N和P联合添加时，表明AMF在NP联合添加时可能参与了养分的吸收。在南厄瓜多尔安第斯山脉和青草高原的高寒生态系统也发现了类似的现象，NP联合添加下AMF丰度的增加。
4 非共生N2的固定和植物N吸收的调控
P添加没有增加非共生固N速率和植物N的吸收。此外，涉及到N吸收的其它过程，例如亮氨酸氨基肽酶活性和净N矿化速率，也不受P添加的影响（Schleuss et al. 2019）。然而之前的一些研究发现P添加增加了非共生固N，因为它为ATP的产生提供了P，但是本研究发现在本研究中的草地中P对N的固定没有限制。理由可能是除了P以外的其它元素（例如，钼）可能限制了非共生N的固定，其它的生态系统中已有报道（Wurzburger et al.2012）。然而，本研究发现，N的添加减少了非共生固N，这可能有不同的原因。首先，非共生N的固定者在N供应时可能会降低固N酶的活性，因为它们吸收活性N比固定N消耗更少的能量（Smith 1992）。与此一致地，本研究发现增加的DN含量与更低的固N速率相关联。其次，固N是一个需要大量能量的过程，因此非共生固N群落依赖于有效的C源来满足它们的能量需求。长期的N添加降低了C的有效性，这表现在N添加处理中的低DOC:DN比，因此可能会导致N固定的能量限制。本研究发现非共生固N与降低的DOC:DN比负相关。这个解释与先前的研究一致，即在实验室试验中发现低C:N比和直接添加无机N会显著降低固N酶的活性。此外，N输入的增加可能会限制固N细菌群落的丰度和多样性(Fani et al. 2000,Reed et al. 2011)，正如减少的nifH基因丰度所揭示的那样。与其他亚热带和热带草地相比，本研究相对较高的N有效性可能解释了为什么非共生固N速率低于热带稀疏草原并且低于热带草原约2倍。
类似于非共生固N速率，植物N的吸收（地上N含量和库）独立于P的添加。这与Craine 等（2008）的结果一致，他发现单独添加P没有改变南非5种不同的草地地上N含量。
5 N和P共同限制的动态
本研究发现随着时间的推移，ANPP对NP添加的响应逐渐减弱。其中一种可能的解释是NP添加导致了一个相对大的土壤有机P库的形成并且加强了P再循环过程，即转化有机P为植物可利用的。此外，长期的N和P添加引起了植物群落组成的巨大改变并且在本研究平台中导致了植物物种丰富度减少了30%。类似地，Isbell 等（2013）发现在北美草地中由于植物群落组成的巨大改变和优势物种的丢失，ANPP对增加的N输入的响应会随着时间的推移而减弱。随着时间的推移，由于长期的营养投入而发展起来的植物群落可能更好地适应营养丰富的条件，但是在增加N和P的情况下，它们不会产生比以前更多的生物量。因此，本研究的结果表明，由于植物群落组成的变化，养分有效性的增加引起的植物生长的响应可能会随着时间的推移逐渐消失。
总而言之，本研究的结果表明地中海草地在66年期间受N和P的共同限制，并且本研究有几个启示，即N和P的交互作用促进了植物P的获取和吸收。这些交互作用可能对ANPP有正效应，解释了ANPP对NP添加的协同效应。N和P的联合添加增加了土壤中有机P的积累，以及通过磷酸酶的再流动。此外，NP联合添加相对于单独P添加增加了AMF基因的相对丰度以及增加了植物P的吸收。相反地，本研究的N循环过程与NP交互作用无关，并且地上生物量N库和非共生固N不随增加的P的有效性而增加。
结论
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