科研 | PNAS：宏基因组学揭示了热带空气生态系统中的微生物群落遵循一个精确的循环
编译：jiee，编辑：小菌菌、江舜尧。
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空气作为一个适合微生物生存的生态系统，但还未被充分研究。本论文描述了热带地区空气微生物介导的精确的昼夜循环。作者在本文中采集了795个来自热带空气的不同时间的样品，进行宏基因组测序，产生了2.27 TB数据。宏基因组分析结果表明：真菌、细菌和植物在近地表大气中的存在都遵循特定的时序。尽管只有9 - 17%的序列可以注释到物种，但空气中存在的微生物多样性足以与地球上其他生态系统的复杂性相匹敌。空气中的微生物遵循一个明显的精确的循环，环境参数是主要的驱动因素，且其中温度是最重要的因素。一天内分类学多样性的变化大于不同天之间和不同月之间的变化。不同时间序列的环境样品揭示了空气微生物群落中存在一个保持13个月不变的核心微生物类群，暗示其具有长期稳健性。与原核生物普遍存在的陆地或水生环境不同，热带空气中的生物量主要由真核生物的DNA组成。特定的真菌和细菌类群与温度、湿度和二氧化碳浓度密切相关，使它们成为研究大气生物气溶胶动力学的合适的生物标志物。
论文ID
原名：Microbial communities in the tropical air ecosystem follow a precise diel cycle
译名：热带空气生态系统中的微生物群落遵循一个精确的循环
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2019.11.12
通讯作者：StephanC. Schuster
作者单位：新加坡南洋理工大学环境生命科学工程中心
实验设计
结果
1.热带空气的微生物多样性
作者首先评估了DVE1中的一个随机空气样本(DVE1011)的物种多样性，并和采自新加坡同一地理区域的海水、土壤和人体肠道微生物样本(每个样本都标准化到200万条reads)进行比较。空气样本中可注释微生物的比例最低(9 - 17%，夜间/白天)，而研究最为深入的人类微生物组在界水平上有高达64%可被注释(图1A)。空气微生物组中无法注释的reads部分包括：35%匹配到未知物种和48%与数据库不匹配。不匹配的序列可能有以下来源：
1)真核生物的基因间区；
2)暴露于恶劣环境条件下而产生变异的胞外DNA；
3)尚未发现的微生物，目前在数据库中没有代表序列。
因此，与土壤和海水相比，空气是目前全球范围内研究最少的生态系统。
图1 微生物群落结构。(A)海洋、空气、土壤和人类肠道生态系统样品中微生物在界水平的相对丰度。(B)四个对应生态系统种的物种数目。(C) 5个DVE宏基因组样品中reads注释到不同分类单元的的相对丰度。(D)根据基因组大小归一化reads数目，估计细菌与真菌的细胞比例。(E)日间和夜间空气样本中微生物的相对丰度。这两个样本是从整个DVE1数据集中随机选取的。(F)相应的日间及夜间空气样本中注释到的物种数目。
2.时间序列环境样品的采集
通过对一个3.3亿reads的超深度测序数据和一个独立测序的400万reads的数据(同一个2小时样品DVE1011)进行比较，作责确定200万条随机取样reads足以对空气微生物中500个最丰富的物种进行鉴定和排序(附录SI，图S2、S5)。这一观察结果，加上最低的生物量的要求，确定了DVE2-5这一时间序列环境样品的采集策略：采样间隔为2小时，每天采集12个时间点。对DVE1-5分别进行了统计分析。在每个测序样品中随机抽取200万条reads，DVE1数据集中平均有12.16%可被注释，DVE2中有10.30%，DVE3中有12.46%，DVE4中有11.66%，DVE5中有8.25%，可被注释的微生物中中大多数属于细菌或真菌(详见附录SI，表S2)。通过对宏基因组学数据的分析，作者在种水平上进行了物种注释(附录SI，图S6，图S7)。在所有时间序列样品(DVE1-5)注释到的微生物中，有725种在整个13个月的采样期间均可检测到，因此被认为是空气菌群中的核心微生物。相比之下，只有74到206个物种只在特定时间序列的样品中出现(图2A和SI附录，表S3)。
图2 空气微生物的时序变化。(A)在5个时间序列样品(DVE1-5)中同时出现物种的维恩图。（B-D）每个时序样品中所观察到的物种数的箱线图。(B)物种丰富度在一天内分布(2小时采样间隔)。(C)物种丰富度的日际变化，考虑5天的日平均值，覆盖DVE2-5数据集。(D)物种丰富度月间变化，取3个月内5天样品的平均值，共覆盖13个月(DVE2-5)。离群值显示为空心圆。
DVE2-5样品间微生物群落的平均丰富度(通过可注释物种的数量进行评估)与一天内的微生物变化显著不同(图2B和SI附录，图S8;RANOSIM=0.62~0.81, PANOSIM <0.001)，然而不同天和不同月之间变化很小（图2C、D，SI附录，图S8;RANOSIM=0.01~0.12, PANOSIM=0.002~0.28）。在24小时内，空气微生物群落的周期性变化可以被重现，这使采集的空气样本可以追溯到采集当天的实际时间。但是，用作者的数据作为参考，想要将样本匹配到特定的月份/季节很困难。
作者总结了7个空气微生物类群随时间的变化来显示每个类群的变化规律(图3A)。测序到的植物相关的reads集中注释在Viridiplantae类群，真菌在Ascomycota和Basidiomycota，细菌在Cyanobacteria、Firmicutes、Proteobacteria、和Actinobacteria。在这些微生物中，植物门和细菌门微生物的相对丰度具有相似的昼夜变化规律(图3A)，在白天丰度更高，在夜间仅能检测到很少。相反，担子菌是唯一一个在夜间丰度高，在白天丰度低的类群(图3A)。另一方面，子囊菌的丰度在中午或降雨时显著增加。这些模式在5个DEV数据集中均可以观察到且具有统计学意义(附录SI, 表S5;Wilcoxon符号秩检验和回归模型分析)。
在中午当气温和太阳辐射达到最大值时，子囊菌的群落丰富度(观察到的物种数量)增加了4倍，而担子菌的群落结构在24小时内非常稳定(图3B)。Viridiplantae的丰富度增加了2-3倍，在中午达到最大值。在上述4个细菌门中，厚壁菌门和变形杆菌群落的丰富度在中午时最大可以增加10倍，而蓝藻和放线菌群落在一天的时间内更加稳定，增加了不到5倍(图3B)。DVE2-5数据集微生物的alpha多样性值见SI附录，图S9。
3.昼夜生物量波动
在时间序列DVE2-5中，以每2小时间隔提取的DNA量近似估计，夜间时段(19:00至07:00)总生物量始终较高(图4A)。DNA的量在5-500ng(每72立方米样品)之间变化，导致清晨(05:00)和中午(13:00)之间的差异高达100倍(例如DVE2)。这一昼夜的规律在干旱季节依然保持,但DNA量下降了30倍，下降到5-150ng(例如DVE3和4)。使用单谱分析后，这种24小时内的波动在连续样本间的成对Bray-Curtis相似性分析和周期波动规律中都很明显(图4B)。
图3 空气微生物的昼夜循环。(A)DVE2-5样品中收集到的总DNA量(ng)的箱线图。(B)通过单谱分析计算连续样本之间的配对Bray-Curtis相似性(灰色)和周期波动规律(红色)。(C和D) DVE2-5中空气微生物群落结构。(C)两组样本中，第一个主坐标轴代表的白天(7:00 - 19:00，橙色圆圈)和第二主坐标轴代表的夜晚(19:00 - 7:00，蓝色三角形)的面积。(D)C图中每个样品到形心距离的箱形图。同时显示PERMDISP2分析的P值。空心圆表示离群值。
图4 空气微生物群落的Diel循环。(A)在DVE2至5期间收集的总DNA产量(ng)。(B)连续样本(灰色)和周期振荡分量(红色)Bray-Curtis相似性。(C和D)结构DVE2 ~ 5中空气传播的微生物群落。(C)两组样本分别代表白天(7:00 - 19:00，橙色圆圈)和夜晚(19:00 - 7:00，蓝色三角形)PCoA图。(D)每组到中心的箱型图。PERMDISP2的P值如图所示。未填充的圆表示离群值。
DVE2-5样品中白天和夜间样品的DNA量具有显著差异(Wilcox检验，DVE2:P=7.24×10-10；DVE3:P=3.98×10-6；DVE4:P=4.98×10-7；DVE5:P=4.63×10-5)。多变量关联分析证实，什么时候采样对微生物群落的影响大于哪天进行采样(SI附录, 表S4)。当假设昼夜对应2种性状时，特定采样时间的隶属度增加。在一天中显著波动的物种在SI附录和表S6中列出。微生物群落结构(图4C和D)在光照时比在黑暗时更分散(DVE2、DVE3和DVE5中群体分散的多变量同质性分析P = 0.001，但在DVE4中不显著:P = 0.14)。白天比夜间的细菌reads数至少多3倍(SI附录，表S7)。
为了协调本研究定量比较分析时全基因组测序数据之间的差异，我们还进行了qPCR分析。分别用16S和ITS引物定量细菌和真菌OTUs的绝对丰度。比较分析表明，细菌类群的相对丰度和绝对丰度一致，而由于数据库和扩增偏差，真菌类群的相对丰度和绝对丰度并不一致(见下文和SI附录，图S10)。
4.对环境因子变化的响应
除了昼夜变化外，空气微生物还对温度、二氧化碳和降雨等环境因子的变化做出反应(DVE2-5的元数据绘制在SI附录中的图S11A)。在新加坡，每日的温度周期通常是一致的，夜间最低温度为26摄氏度，白天最高温度为35摄氏度(SIAppendix, Fig. S11A)。相对湿度从傍晚的50%到后夜时的90%不等。在计算每个时间点的绝对湿度时，还可以观察到夜间高湿度和白天低湿度的一般模式(SI附录，图S11A)。附录SI，表S8显示了温度和相对湿度的相互依赖关系，也称为饱和水汽压。近地面大气中二氧化碳的昼夜循环主要是植物呼吸作用的结果，其变化范围从夜间的400ppm到白天的460ppm (SI附录，图S11A)。DVE3白天的样品记录了大风情况下得出的环境参数与其他时间序列测量结果明显不同(SI附录，图S11)。
在所有环境因素中，温度对空气微生物群落的影响最大(图5A)，其次是二氧化碳水平(图5B)。气温升高与细菌类群和子囊菌群丰度升高呈正相关，而真菌种的担子菌类群呈负相关(图5C)，且具有很强的统计相关性(Pearson相关性 R > 0.75或<0.75)。特别是在DVE2样品中，取样的第2晚和第4天的异常温度模式可以被几个微生物的丰度模式很好地反映出来(图5C)。值得注意的是，所有的细菌门都与温度的升高呈正相关，而典型的负相关只存在于蘑菇菌纲的担子菌属(如：Heterobasidion irregulare, Moniliophthoraroreri, Auricularia delicata, Tulasnella calospora)。这些结果在整个时间序列样品DVE2-5中都是稳健的(参见SI附录的表S9)，并得到通过回归建模获得的高度显著相关性的支持(SI附录的表S10)。
图5 空气中真菌和细菌应对环境因素的昼夜变化。(A和B)绘制物种丰富度(观察到的物种数量或chao1指数)与特定采样时间点的温度(A)和二氧化碳(B)的关系图。红线为回归线。橙色和蓝色的点分别对应白天和夜晚的时间点。给出了chao1指数与温度/CO2的Pearson相关指数。(C)温度。八种微生物的丰度随温度的变化而变化。大多数对温度有正相关的物种是细菌，有9种真菌呈负相关。(D)二氧化碳。两种真菌对二氧化碳的昼夜变化。两种环境因素引起的观测波动高度相关(Pearson相关性 R > 0.75或< 0.75)。
5.建模
图6 微生物类群和环境参数之间的概率相互作用的网络。每个节点表示系统的一个变量，每条边表示一个变量对另一个变量的影响。此外，每个节点都与一个概率表相关联，该表指示在缺乏系统信息的情况下，变量处于特定状态的可能性。一旦有关其他节点状态的信息可用，每个节点的概率表就会更新(重新计算)。场景1模拟了一个典型的正午时间点，此时温度达到最大值。为了应对高温，我们重新计算了其他变量，做出了新的预测(例如，二氧化碳的含量可能很低，而细菌的相对丰度可能很高)。低温场景2(典型的夜间场景)和场景3(典型的降雨场景)模拟了热带地区典型的局部气象事件。
6.大气颗粒物分布与环境污染物
利用光学和扫描电子显微镜观察不同形态和大小的生物和非生物颗粒(SI附录，图S13)。颗粒和微生物细胞分散分布，并没有附着在基质上(SI附录，图S13A)。此外，从光学颗粒计数(OPCs)(SI附录，图S14)和收集的总生物量(如总提取DNA产量)(SI附录，表S11)可以看出，不同粒径之间并没有明显的相关性。颗粒大小与上述7个微生物类群的丰度也没有相关性(SI附录, 表S12)。用荧光和光学显微镜可以看到，有相当一部分的粒子属于非生物物质(SI附录, 图S13B和D)。此外，多细胞生物，以及有一个或多个细胞核的单细胞生物也能够被识别(SI附录,图S13B)。其中一些图像似乎代表了子囊菌和担子菌的真菌生活史的双核阶段(SI附录，图S13B)。作者还监测了环境污染物的每小时浓度，如氮氧化物(NOx)和硫氧化物(SOx)，与报告的生物量波动和分类分布的关系。然而，这两种化学物质都可以被排除在驱动空气中微生物昼夜循环的因素之外(SI附录,图S15和S16)。
讨论
由于可获得的生物量较少，因此对空气样本的宏基因组学分析在技术上具有挑战性，因此以前仅限于长采样时间间隔、大量空气和使用基于扩增marker基因的研究方法。空气中微生物的组成以前被认为是由于气象、空间和时间因素的变化而不断变化的。然而，作者在热带地区5个时间序列的采样，跨度达13个月，得到了一个高度稳健的725个核心微生物类群。考虑到气流的速度和季风在热带季节的相反方向，作者观察到的热带空气微生物群落的鲁棒性是出乎意料的，特别是与温带气候相比。然而，在白天和夜间的样品中，微生物组成的变化很大，而不同日之间和和不同月之间的变化不太显著(图2和SI附录，表S7)。通过高时间分辨率对空中生物群落组成进行可靠的评估，甚至可以对极低的生物量环境进行调查，从而确定研究中相关生态系统(如大气)的规模和边界。未来对空气微生物的源和汇的研究应当考虑昼夜之间的巨大分类学差异。因此，需要注意的是，在未来的研究中需要考虑一致的太阳仰角(真实太阳时间)，因为这些将控制最相关的环境参数，如温度和相对湿度。从作者的宏基因组学研究中可以看到> 1200微生物类群在5个时间序列数据中的时间分布。尽管作者所观察到的昼夜生物量波动的机制目前尚不清楚；但是生物颗粒（如孢子）的主动释放，曾有过报道。此外，生物气溶胶浓度的动态也可能受近地表大气的气象过程控制，如大气水微滴的形成。
作者对热带空气深入地分类学分析揭示了：空气微生物与其他研究充分的生态系统(如海水、土壤和人类肠道)具有相似的复杂性。与其他生态系统相比，热带空气中的真核微生物比例较高。真核生物中，担子菌和子囊菌数量最多，而植物DNA含量较少。与海洋生态系统不同，空气中只含有少量的噬菌体和古菌。虽然子囊菌科是自然界中最丰富的真菌门，且在温带气候区空气中分布广泛，但担子菌科在热带地区更为丰富(32)，尽管它们的时间分布和群落动态此前未知。
作者从全部序列数据的一小部分中观察到的热带空气微生物群落很高的多样性，这特别值得注意。因为空气生态系统在物种多样性和丰富度上与海洋和土壤微生物群落相似，但是典型夜间样本中只有9%的可注释序列，日间样本中有17%。在2小时间隔采样时，空气样本中有超过400个物种，在5天的单一时间序列样品中有超过1200个物种。
评论
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