科研 | 污水处理厂外排水可能促进耐药基因的全球传播
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经处理的废水排放到环境中会干扰自然微生物群落的分类组成和功能基因库(包括抗生素抗性基因)。研究使用宏基因组学方法分析了不同稀释度的外排水扰动下水体中原生细菌群落的短期响应，揭示了微生物群落组成以及可能对人类健康构成间接风险的抗性体的范围和数量。研究发现扰动后群落的分类学组成受特定随机过程驱动，然而耐药基因组有一个确定的轨迹，即不管分类组成的差异、抗生素抗性基因丰富度与细菌类群、细菌群落的表型特征和废水处理的类型，在比例较高的污水废水中都能迅速稳定其功能特征。在接受废水的淡水水体中观察到的耐药基因组的确定性增殖表明，这一过程可能促进抗生素耐药性的全球传播，因此需要新的立法促进废水再利用的替代三级处理，并针对细菌的功能特性而不仅仅是细菌的丰富度。
论文ID
原名：Effluents of Wastewater Treatment Plants Promote the Rapid Stabilization of the Antibiotic Resistome in Receiving Freshwater Bodies
译名：污水处理厂外排水促进了接受淡水水体中抗生素耐药性的快速稳定
期刊：Water Research
IF：7.051
发表时间：2019年
通信作者：GianlucaCorno
通信作者单位：意大利国家研究理事会-水研究所微生物生态学组
实验设计
实验采用3个重复分批培养法进行(Figure 1) (1 L水加入3 L 锥形瓶，无菌充气)， 分5步形成稀释梯度：100% 污水处理厂外排水， 90-10， 50-50， 10-90， 100% 接受环境水，没有补充任何额外的营养。所有细菌群落都进行了30 µm滤膜预过滤以去除大颗粒和浮游动物捕食者，但是纳米级捕食者 (原生生物) 依然存在。考虑到不可能确定马吉奥尔湖（Lake Maggiore）废水的稀释率，实验装置的设计与诺瓦拉（Novara）污水处理厂外排水在Agogna河中的稀释效果相当，介于1:1 (干旱期) ~1:10/1:15。实验在诺瓦拉进行了96小时，在坎诺比奥（Cannobio）和（韦尔巴尼亚）进行了144小时，为获得受控气候条件下微生物群落的相对生长条件(丰度) (黑暗，10°C)，每24小时从每个烧瓶中收集10 mL微生物分析样品，同时在开始和结束稀释实验时收集样品进行宏基因组分析(500ml), 采用0.22µm聚碳酸酯过滤器过滤，在-20°C储存到分子处理。流式细胞仪的显微镜和总体微生物计数的子样本被固定在甲醛中 (1%)同时立即处理用于评估完整/受损细胞的样本。
图1 实验设置。采样点和实验方案的总体设计，对污水处理厂和接收水体进行总体描述。CN: Cannobio(城市+工业;过氧乙酸消毒)，NO: Novara(城市+工业;紫外线辐射)，VB: Verbania(市区; 加氯消毒)。
结果
细菌群落的耐药基因组揭示了ARGs组成的差异（基于丰富度的布雷-柯蒂斯差异来衡量）在每次实验的结束和开始之间（15个实验:五个稀释率从0到100%污水处理厂外排水，每一个来自三个配对的地点环境污水处理厂，图1）都显著受到稀释率影响(LM as ANOVA output: F 1，9 =11.5， p=0.008; 图 2A) ，这意味着污水处理厂低比例污水产生的耐药基因组与污水的和与开放接纳水体混合前的截然不同，而较高比例污水处理厂外排水稳定了同类耐药基因组，其ARGs组成与原始的更为相似。试验开始和结束时的耐药基因组差异既不受污水来源和污水处理厂外排水地点的差异影响(Cannobio， lake; Novara， river; Verbania， lake; F 2，9 =0.9， p=0.429)，又不受稀释与原生地相互作用的影响，即稀释对所有类型的水体和污水处理厂中ARGs组成的影响是相同的(F 2，9 =1.8， p=0.224)。因此，在污水处理厂外排水比例较高时，该耐药基因组的ARGs组成更加稳定，表明污水处理厂外排水的扰动强度具有稳定作用，这与污水处理厂的消毒处理方法有何不同、污水的来源和接收水的类型无关（Supplementary File 1）。
污水处理厂外排水的排放似乎促进了新建立的环境耐药基因组快速稳定；然而，如果存在与携带特定ARGs的特定分类群的物种特定关联，这种ARGs的改变也可以解释为微生物群落分类组成稳定的副产品。在整个实验过程中，我们通过分析细菌群落的组成和丰富度来检测这种混杂因子。实验结束时和实验开始时操作分类单元(OTU)组成的差异不受分析变量的影响；既不是稀释的程度(F 1，9 =3.6， p=0.090) (Figure 2B)，也没有产地之间的差异(F 2，9 =1.2， p=0.345)，也不是这些项之间的相互作用(F 2，9 =0.5， p=0.598) 对其分类学组成有一定影响。此外，OTUs的丰富度在实验的开始和结束之间没有变化(paired t-test: t=1.8， p=0.090)。在分析秩序或阶级层次上的组成和多样性时，也发现了同样的模式(Supplementary File 1)
图2 耐药性基因和微生物体的稳定性。根据Bray-Curtis的不同，在实验开始和结束时，表达为ARGs组成的抗性体的功能特性(A)和表达为OTUs的微生物组的分类学组成(B)的差异，从0到100%的五种稀释。Bray-Curtis相异的范围从1 = 0 = 完全相同的完全不同。只有当对所有数据的总体测试(虚线)显示支持关系时，才会报告单个趋势线(仅在A中，而在B中没有显著的r) 虚线表示总体趋势线;黑点和线表示Cannobio，红点和线表示Novara，青色点和线表示Verbania 污水处理厂。
在所有被分析群落的微生物组中，在野外采集或者在实验中测量，OTU丰富度的差异不受产地差异的影响(F 2，12 =1.0， p=0.387)，只是稍微受水的种类影响(F 2，12 =4.5， p=0.034)，产地与水的类型的有限影响(F 2，12 =3.5， p=0.040)，这表明，污水处理厂排放的污水与环境中细菌群落的类群数量存在一定的差异，但差异不大(Supplementary Figure 1)。
对抗生素耐药性稳定的另一种解释可以通过实验中ARGs丰富度的变化来解释，例如，只有少数ARGs在高剂量的WWTPs废水中存活，然而，ARGs的丰富度在实验的开始和结束之间并没有改变(paired t-test: t=0.6， p=0.556)；而且，在实验结束时对群落的耐药基因组进行了分析，ARGs的数量与稀释程度无关(F 1，9 =0.66， p=0.436)，产地之间也没有差别 (F 2，9 =0.04， p=0.961) (Supplementary Figure 2)。从宏基因组数据中获得的系统分类(MetaPhlAn2)显示，只有24个OTU不含接收水体的微生物群落， 然而有150个不含污水处理厂外排水，94个在两类水之间共有；4个OTUs (Aeromonas， Arcobacter， Deinococcus， and Brevibacterium) 作为污水处理厂废液的指示值和3个OTUs (Pseudomonas， Limnohabitans， and Sphingobium)试验指示值(Supplementary Table 1)。OTUs的地理分布证明了诺瓦拉遗址的独特性，在所有被检测到的OTUs中，约有50%是唯一存在的；剩下的50%为这3个地方共有，数量有限的OTUs只存在于韦尔巴尼亚（Verbania）（19个OTUs），仅在坎诺比奥（Cannobio）中检测到的OTUs就更少了（4个OTUs）(Supplementary Figure 3) 。
在我们分析的3种主要类型的水(环境、污水处理厂和 试验)之间，耐药基因组略有不同 (R 2 =0.16， p=0.0126) ，产地之间的差异更大( R2 =0.17， p=0.0038)， Novara不同于其他两个地点。两项之间的相互作用不显著(p=0.0715)。稀释实验结束时，不同处理之间ARGs组成差异的驱动因素是起始位点（R2 =0.26， p=0.0006)，以及稀释的比例 (R 2 =0.20， p=0.0001)。在这个研究，我们识别出350种不同的ARGs，其中38项不包含接收水体和94项不包含污水处理厂外排水。共有耐药性基因组 (同时存在于环境和废水中的基因) 84个，约占所有ARGs的 40%。与来自环境的原始水和污水处理厂外排水相比在实验设置中没有检测到额外的ARGs，在稀释实验中，证实了该方法的可靠性以及在原始水体中没有未检测到ARGs的事实。最多样化的基因是那些能够抵抗β-内酰胺的基因，有115种不同的ARGs类型 (53.9% 只存在于污水处理厂外排水中)，其中，由于OXA和TEM基因组的代表性较好，因此特别有趣，它们是污水处理厂外排水的典型代表 (38个基因变异中有27个)，而后者更代表环境(30个基因变异中有28个要么是完全环境变异，要么是共有变异) (Table 1)。
表1 抗生素耐药性基因(ARGs)的来源跟踪。在实验开始时，未稀释处理(100%或0% WW)中存在的不同ARGs的数量。根据检测，ARGs被指定为只存在于接收水体(环境)、污水处理厂污水或它们之间共有的。第一列表示所提供的抗性，最后一列是特定基因的名称。
ARGs的其他家族(比如tet和 sul 基因) 大部分是在不同水域之间共有，检测到的ARGs的地理分布(Supplementary Figure 3) 显示出很大一部分的耐药基因组(几乎一半被检测到的基因) 在三个地点之间共有，而其中只有三分之一是针对单个样点的，结果表明6个ARGs 为环境水体指示值：cat (抗氯霉素)、bla TEM-75、a generic metallo beta lactamase， tlcC、vatA (Macrolide-lincosamide-streptogramin group)和 aph3-IIb (抗氨基糖甙类)， 其中三种ARGs是污水处理厂外排水的典型特征: bla OXA-1、bla FOX-4 (抗内酰胺)和 aac2-I (抗氨基甙类抗生素) (Supplementary Table 2)。考虑最相关的ARGs家族 (Supplementary Figure 4)，并分析它们是在环境中更丰富还是在污水处理厂外排水中更丰富，在环境中氨基糖苷的基因数量明显减少(TukeyHSD p=0.0034，beta-lactams p=0.0069)， 而其他ARGs组则无显著差异。从实验开始到结束，单ARGs的动力学特性(Supplementary Figure 5)显示了仅用环境水和10%的污水处理最常见的基因丰度下降，而对于含量最少的ARGs和其他稀释处理没有明显的趋势。同时，相互矛盾的情景描述了同一基因的不同亚型(如 bla TEM和bla OXA )，没有明确的选择，以支持特定的形式，或其起源。
细菌丰度、适应度和表型分布 (Figure 3; Supplementary Figure 6) 受所采用的消毒处理方法影响，当它们与自然群落混合时，它们的恢复在时间和数量上是不同的。每个实验梯度处理结束时，根据细菌的丰度和培养基中营养物质的完全耗尽之前建立梯度处理。利用微生物丰度对污水处理厂外排水进行表征显示在Cannobio和Verbania少于1 x 106 cells·mL -1 ，在 Novara差不多为 4 x 10 6 cells·mL -1， 而接收水体的丰度均小于1 x 10 6 cells·mL -1，在 Agogna 河流特别低，少于 0.2 x 10 6 cells·mL -1。混合群落 (根据水量调整比例) 是由Cannobio和Verbania两种来源的细胞比例大致相等的细胞组成，在Novara污水处理量分别为10、50和90% 主要由来自污水处理厂的细胞组成。 在Verbania的整个实验过程中，0和10%污水处理厂外排水中的细菌数量保持稳定，而在实验的第一部分，它在坎诺比奥和诺瓦拉迅速上升，然后随着营养物质的减少而下降 (Figure 3). 在所有处理中，完整细胞在整个实验中的比例仍然很高(一般高于90%)，大团聚体的数量是恒定的(Supplementary Figure 6)。
图3 细菌的丰度和完整细胞的比例。细菌细胞的数量(左列)和相对完整的细胞比例(右列)为实验期间每24 h测量。值表示为Cannobio、Novara和Verbania三个站点的三个平行。不同的颜色是指不同比例的污水处理厂污水(WW)在混合处理。
在 Verbania， 90%~100%污水处理厂外排水细菌丰度几乎降至0，可能是由于氯化作用的剩余影响，但随后在实验结束时又上升到大约7 x 10 6 cells· mL -1 ，而WWTP废水完整细胞的比例也从小于 10% to 90% ；在 Novara ，90% ~ 100% 污水处理厂外排水中，细胞数量在48小时内保持稳定，然后迅速下降，完整细胞的比例也有类似的趋势；在 Cannobio， 90% ~ 100% 污水处理厂外排水中，细菌细胞的数量和完整细胞的比例在整个实验过程中保持稳定。
用于细胞数量和生存能力的测量（活细胞数、活细胞比例和聚集物数），与处理之间的差异相比，由于重复之间的可变性而引起的差异可以忽略不计。统计模型包括产地、稀释处理、实验日期及其相互作用，其R2值范围在0.98 ~ 0.99，这意味着模型中只有不到2%的变异是由于复制之间的差异造成的。
通过比较细菌丰度、适应度和大小分布的数据，我们证明了每个因子的各个水平的复制之间的高度相似性 (Figure 3; Supplementary Figure 6)，然后，我们选择细菌丰度中等的复制进行宏基因组分析。此外，为了进一步控制每一分析水平的三个重复之间遗传分布的可重复性，采用定量方法(qPCR)对4种标记物检测了16S rRNA 基因和3个 ARGs (tetA， ermB 和 qnrS) 并通过样品间的分布规律不同，分子量、碱基组成和长度进行表征。对于所有的标记基因，由于重复之间的可变性而引起的方差可以忽略不计，与产地、稀释处理及其相互作用之间的差异相比tetA的 R2为 0.89、，ermB的为0.91、qnrS的为0.95，16S rRNA基因的未 0.96。这意味着，在最差的模型中，只有不到11%的变异，而在最好的模型中，只有4%的变异是由于复制之间的差异造成的， 这支持在我们执行的宏基因组分析中只可靠地使用一个复制。
讨论
自然环境通常被认为是稳定、耐药和有弹性的生态系统: 常驻细菌群落是由占据生态位的类群组成的，通过生态相互作用的复杂性增加对干扰的内在抵抗力，相互作用体现在有机体之间以及节点和连接的冗余。扰动强度是决定扰动本身对生态系统影响的驱动因素，这样，生态系统就有可能保持或恢复它原来的状态。在我们的研究中, 通过实验改变人为干扰引起的强度，通过引入污水处理厂污水排放到接收环境水体中， 我们可以调整当地细菌群落的反应，正确理解污水处理厂外排水排放对环境影响的问题。
我们的实验结果给出了最相关的结论，污水处理厂排放到接收环境中的污水比例的增加，可能促进新形成的微生物群落耐药基因组的稳定性（即在给定系统中检测到的所有ARGs的组）。然而，没有发现任何证据表明类群可以驱动这一过程。同时，总体细菌分类学组成没有明显的时间趋势，没有明显的变化规律，往往独立于污水处理厂外排水稀释。与此同时，微生物群落的对比趋势没有显示出任何清晰的轨迹，而耐药基因组则显示出一种共同的均质模式，不考虑处理组和接收水的不同，实验结果表明， ARGs稳定性作为受干扰群落的一种功能特征，可能会发生变化，即使细菌组成不稳定。我们的实验表明，这种现象可能发生在各种接收环境中，因为我们使用的水具有不同的性质:高度受影响的河流（意大利River Agogna），河流的细菌群落单一而不稳定和亚高山湖（意大利Lake Maggiore），湖里的微生物群落复杂而稳定。微生物群落在每次实验中都是随机发展的，而在实验结束时却没有产生一个相似的群落(既不是在分类学成分上，也不是在细菌的适宜性或丰度上)，在解释结果时，似乎也没有把对实验室条件的适应排除在混淆因素之外。
此外，随着污水处理厂外排水比例的增加，各耐药性基因的ARG组成相对于各自的微生物组稳定可能适用于不同类型的污水处理厂外排水。在本研究中，我们使用了含有(Novara和Cannobio)和不含(Verbania)一定比例工业废水的城市污水处理厂的废水。不同的污水处理厂采用不同的消毒处理方法：Novara的紫外线辐射，Verbania的氯化，Cannobio的过氧乙酸消毒，并对实验群落产生了长期影响（存在数小时的氯化或过乙酸的有毒副产物;在紫外线消毒后，出现完整但已死亡或不活跃的细胞等）。这些差异可能是导致在细菌组成、丰度和适合度方面检测到的趋势相反的原因。然而，独立于处理过的水和消毒技术的差异，随着污水处理厂外排水比例的增加，ARGs的组成趋于稳定(差异较小)是一种常见的模式，表示系统中的确定性过程：同样的功能特征，表示为相同的ARGs，受干扰选择，忽略细菌类群可以在干扰下存活。中国17个大城市污水中的抗生素耐药情况表明，在不同的微生物群落中存在着大量的共同且稳定共享的ARGs。同样的研究表明，污水的稀释是决定耐药性基因组成和季节性的一个潜在因素。虽然季节性对ARGs在环境中的传播和持久性的影响已经进行了深入的研究，证明了冬季抗生素用量、自然微生物演替和温度的影响，废水稀释对环境微生物群落和抗性的影响尚不清楚。大多数关于污水处理厂外排水稀释对天然水体中抗生素耐药性决定因素影响的研究集中在低浓度抗生素的潜在影响上，没有分析新形成群落中抗性基因的生态命运。我们的研究第一个支持了稀释率在稳定ARG组成中的主要作用。
另一个最近的研究证明了丹麦城市污水处理厂内微生物群落和微生物群落的长期(7年)稳定性。该研究证实了污水处理厂中微生物群落耐药性的特异性，证实了早期的研究，并提出了稳定的微生物群落与稳定的耐药基因之间的相关性。在我们的研究中，高输入污水处理厂外排水的抗性体(功能稳定性)的总体稳定独立于整体微生物体(成分稳定性)的稳定，意味着，耐药基因组通常携带在细菌基因组的可移动或可移动部分，作为扰动后新建菌落的早期评估特征。这一现象背后的原因是有争议的，因为一旦污水处理厂的污水及其微生物负荷被引入环境，许多同时发生的干扰因素就会对自然群落产生影响。当然，在大多数环境中，污水比例的增加促进了营养物质的普遍增加，因此选择了快速生长的细菌，这是典型的富营养化系统，在非富营养化接收水体中可能是异源的。同时，在污水处理厂外排水和人类受影响的接收水体中，重金属、药物和其他污染物的存在可能有利于多重耐药性的选择现象。所有这些条件都可以促进ARGs的持续存在，并将其传播到新形成的群落中，但是，仅凭这些条件，没有一个可以证明耐药基因的稳定性。此外，整体菌群和耐药菌群也没有发生同样的变化，这意味着耐药菌群的稳定可能是在出水比例较高的情况下发生的，与整个细菌分类学组成的发展无关。
附加条件有利于稳定ARGs的组成:控制细菌丰度的生态因素（例如，病毒裂解和纳米鞭毛虫和较大的浮游生物的选择性捕食），也促进DNA片段大量释放到水中，那些可能包括ARGs，同时，污水处理厂的污水也在释放，以及处理过的废水和原居住的微生物群落，大量的游离DNA，包括经消毒杀灭的耐药细菌和病原体。在污水处理厂污水排放的常见情况下，水体中的天然细菌群落包括有能力的细菌，这些DNA可以通过水平或垂直转移进入新形成的微生物群落，从而促进了污水处理厂地表水微生物群落的稳定。此外，经三次处理后的污水处理厂污水中通常含有丰富的游离DNA，可能与水中的有机物或粘土颗粒结合保持系统稳定。在污水处理厂外排水比例较高时，ARGs中组分的稳定性较好，因此，要求更谨慎地使用和重复利用废水。实施新的质量参数，包括稀释以及抗药性的分子标记（要么是抗性基因，要么是特异的DNA片段）。
一般来说，像湖泊或海洋这样的环境可能较少受到稳定耐药基因组现象的影响，由于那里排放的污水被大量稀释，即使对湖泊和水域造成严重影响，仍然可以显示出减少污染源污染的重要梯度。河流或灌溉渠等水体的情况则不同，那些污水处理厂可接收大量污水，在一年的某些时段，，废水占其自来水的90%。例如，2016年1月Agogna河的自然条件是，流量非常有限，而Novara污水处理厂的出水基本稳定在0.45m3s-1, 相当大比例的河水(25-55%)排放在其中。
我们的实验研究表明，污水处理厂外排水稀释率对开放水域中抗性体的即时稳定有直接的影响，而不受其相对微生物群的影响。与我们的研究相比，对环境的影响甚至更大。在我们的短期实验中，我们在初次接种后的几天内测试了新形成的混合群落的发育情况，而在自然界中，污水处理厂外排水的扰动是恒定的，可以定义为连续的压力扰动。这可能会降低受干扰群落的复原能力，而重建稳定群落需要复杂的途径，为异源性细菌和基因打开特殊的机会，从而建立异源性抗性。对于长期不稳定的群落尤其如此（比如小河），如农业土壤，无法通过长期弹性抵消点扰动的影响。
结论
我们的实验研究表明，污水处理厂外排水不受控制地稀释排放到开阔水域可能造成威胁，我们的研究结果表明，为了保持较高的稀释率，应控制和限制污水处理厂外排水在地表水中排放的比例，至少在新的处理方法有效地去除废水中的耐药基因组之前是如此。随着未来十年农业废水回用的预期增加，需要获得含有有限抗性基因的废水是重要的，抗生素耐药性的传播可以从环境直接传播到食品，对人类健康造成更大风险。
评论
此研究中，使用宏基因组学方法分析了不同稀释度的废水扰动下水体中原生细菌群落的短期响应，揭示了微生物群落组成以及可能对人类健康构成间接风险的耐药基因组的范围和数量。发现在较高比例的外排水中能迅速稳定其功能特征，在接受废水的淡水水体中外排水可能促进抗生素耐药性的全球传播。并提出了再利用替代三级处理和针对细菌的功能特性而不仅仅是细菌的丰富度的废水处理改进措施。本文通过室内模拟的方法，在分析方法上综合了宏基因组学、16sRNA扩增子测序及RNA-seq等多方面测序技术，在污水处理工程基础研究中值得借鉴。
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