科研 | ISME：微多态性确保了在不断变化的环境条件下维持微生物群落的功能
编译：风季，编辑：十九、江舜尧。
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微多态性是指基因序列的多样性，可以导致同一物种的不同生态型，这被认为是为物种提供了时间和空间上的稳定性。然而，微多态性在整个微生物群落稳定性中的作用仍未得到充分的研究。了解微生物群落稳定性的驱动因素对于预测微生物群落对未来干扰的响应具有重要意义。作者分析了美国威斯康辛州8个不同温带沼泽湖泊16S rRNA基因扩增子在97%-OTU（分类单元）和 ASV(扩增子序列变异)水平上的表达情况，发现同一OTU内的生态型具有不同的时空分布模式。作者观察到，这些生态型适应不同的环境因素，如水温和氧浓度。研究结果表明，在同一OTU中存在多个ASVs有利于其在不断变化的环境条件下的持久性。因此，作者认为，微多态性有助于微生物群落在面对环境因素波动时保持稳定。
论文ID
原名：Microdiversity ensures the maintenance of functional microbial communities under changing environmental conditions
译名：微多态性确保了在不断变化的环境条件下维持微生物群落的功能
期刊：The ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019年7月
通信作者：Fernando Puente-Sánchez
通信作者单位：西班牙国家研究委员会国家生物技术中心
实验设计
如图S1所示，作者分析了美国威斯康星州8个温带沼泽湖泊表水层和深水层的1505个样品（主要集中在2005年、2007年、2008年和2009年的无冰期），这些湖泊因混合状态而各异，其中三个属于多次混合型湖泊（FB、CB、WSB），三个属于双季对流混合型湖泊（NSB、TB、SSB），另两个属于半对流湖泊（HK、MA）。本文中所使用的序列数据来源于欧洲生物信息研究所，通过利用Illumina HiSeq平台对16S rRNA基因V4区进行扩增测序。
图S1 采样湖泊的特征及分布。
结果
1 浮游细菌的多样性和动态变化
首先，作者分析了OTU水平湖泊中的细菌多样性（图S2）。所有湖泊中最丰富的OTU 属于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。最常见的OTU是β-变形菌Polynucleobacter necessarius（PnecC），其在所有湖泊中相对丰度较高，其次是放线菌acI-B2。具有相同混合状态的湖泊在四季中具有同样丰富的类群（图S2）。例如，多核杆菌 PnecC和放线菌acI-B2是多次混合型和双季对流混合型湖泊中相对丰度最高的OTUs，但在多次混合型湖泊常伴随着放线菌acI-B3和疣微菌Verrucomicrobia，在双季对流混合型湖泊中常伴随变形菌和酸杆菌。相比之下，这些OTUs在半对流湖泊中较少。
为了评估样品中群落组成的相似性，作者采用了去趋势对应分析（DCA）研究表水层和深水层的OTUs和ASVs丰度数据（图1）。在OTU和ASV水平下，样品按照湖泊和混合状态进行聚类（PerMANOVA test，P<0.001）。来自半对流湖泊的样品与其它湖泊的样品表现出明显差异，相反，来自其它两种混合状态的湖泊样品在组成上更为相似。WSB湖泊的样品与其它多次混合型湖泊的样品没有聚为一类，可能是由于WSB湖面积较大，比其它两个次混合型湖泊更深，从而导致群落组成的差异。
正如Procrustes分析所示（图1），具有OTUs和ASVs的样品聚类显示出良好的一致性，因为这两种情况下的样品都聚集在原始湖泊附近。然而，来自ASVs的信息表明，在群落组成上有着更细微的差别。例如，在OTU分析中，来自HK湖和MA湖的深水层样品聚为一类，但是当使用ASVs分析时，它们是沿着DCA排序轴2进行分离（图1）。
图1 不同湖泊表水层和深水层微生物群落组成的去趋势对应分析(DCA)。
为了寻找可能的季节模式，作者还绘制了连续两年或两年以上取样的四个湖泊的时间衰减曲线（图2，湖泊MA、NSB、TB和SSB)。无论作者考虑的是OTUs还是ASVs, Bray-Curtis差异对来自不同季节的样品来说是最大的，对在一年的同一时间收集的样品来说是最小的。然而，即使在后一种情况下，Bray-Curtis的差异也相对较高(ASVs为0.521，OTUs为0.462)，这表明，虽然可以看出季节性趋势，但群落组成的年际变化更为明显。
图2 湖泊NSB、TB、SSB、MA的相似性衰减图。
2 同一OTU的ASVs表现出不同的生境分布
为了探讨微多态性的生态意义，作者分析了样品中相对丰度最高的OTUs内ASVs的分布及生境偏好。图3和图S3中的雷达图显示了不同湖泊（彩色编码内环）和热层（灰度编码外环）中最丰富的OTUs中的平均丰度。OTU-1（多核杆菌PnecC）在数据集中具有最高的相对丰度，由三个主要的ASVs组成（ASV-1、ASV-2和ASV-48）。在NSB的深水层中，ASV-1丰度高于ASV-2；在FB的表水层中，ASV2的丰度更低。反过来，这两种ASVs的丰度总是高于ASV-48。为了确定ASV的栖息地偏好而不考虑它们的丰富程度，在雷达图的下排绘制了z值图（图3）。正z值表示ASV高于平均丰度的湖/层组合，反之亦然。
图3 同一OTU的ASVs表现出不同的生境分布。
多核细菌PnecC的三种最丰富的ASVs显示出不同的分布：ASV-1在双季对流混合型湖泊中的深水层表现出较高的相对丰度，ASV-48在多次混合型湖泊和NSB的表水层中丰度较高，而ASV-2虽然在大多数湖泊中都存在，但在FB中最为丰富。ASV-1和ASV-2在不同湖泊中的分布差异如图S4所示。虽然ASV-2在多次混合型湖泊中普遍存在，但在其它湖泊中，ASV-1和ASV-2共存。
在其它OTUs中也出现类似情况。在OTU-2（放线菌acI-B2）中，ASV-4在CB中具有较高的相对丰度，而在双季对流混合型和多次混合型湖泊的深水层中，ASV-18的相对丰度更高。另一方面，ASV-5在半对流湖泊中出现的频率较低，尤其是在HK湖，但对CB湖泊的表层水和深水层表现出一定的偏好。OTU-3（Gammaproteobacteria gamI）说明了来自同一OTU的两个菌株具有相似的空间偏好的情况：ASV-3和ASV-31都优选TB湖泊。然而，在ASV-3存在的几个湖泊中没有ASV-31。最后，在OTU-7（Bacteroidetes bacIA）中，ASV-29在CB和NSB湖泊中具有较高的相对丰度，而ASV-44在FB湖泊中的相对丰度较高（图3）。
作者在其它OTUs中也发现了类似的情况。例如，Acidobacteria Geothrix（第五丰富的OTU）存在于TB和SSB湖泊中（图S2），但从ASV水平来看，ASV-6在TB湖泊中的相对丰度较高，而ASV-15在SSB湖泊中的相对丰度较高（图S2）。OTU-4（Actinobacteria acI-B3）存在于三个多次混合型湖泊中（图S4）。ASV-8在FB湖泊中占主导地位，但ASV-8和ASV-10在其它两个湖泊中均占主导地位（图S3、S4）。总的来说，在大多数湖泊和热层中都存在大量的OTUs，但其组成的ASVs只对其中的一些表现出偏好。
图S3 OTU- 4、OTU-5、OTU-6和OTU-8的环境偏好。
图S4 整个数据集中最丰富的15个ASVs的相对丰度。
3 同一OTU的ASVs表现出不同的时间动态
来自同一OTU的ASV不仅表现出不同的空间分布，而且还显示出不同的时间动态，如NSB中所示（图4），在2007-2008年期间，多核杆菌PnecC（OTU-1）的相对丰度相当稳定（图4a）。然而，其两个最丰富的ASV（ASV-1和ASV-2）随着时间的推移改变了它们的相对丰度：一般来说，ASV-1在深水层中更丰富，而ASV-2在表水层中更为丰富，但ASV-1在2008年春季的表水层中占主导地位（此时表层水体温度仍然很低）（图4a）。在双季对流混合型湖泊TB和SSB中也观察到类似的趋势（图S4），这表明每种ASV可能适应不同的水温。
图4 同一OTU的ASVs在NSB中表现出不同的时间动态。
另一个例子是Gammaproteobacteria gamI（OTU-3），它可以被分配到甲烷氧化菌Methylobacter。OTU可以分解成两个主要的ASVs：ASV-31（2007年秋季混合期间暴发）和ASV-3（在下一个春季混合之前保持中等丰度）（图4b）。ASV-31的暴发增长与整个水柱中的瞬时氧气耗尽同时发生（图S5）。
图S5 NSB的温度和溶解氧分布。
4 微多态性在较高的分类学水平上赋予稳定性
一般来说，相对丰度最高的OTUs至少由两个在空间和季节上具有不同分布的ASVs表示，这表明存在着不同的生态型，它们的环境偏好略有不同。作者探讨了丰富的微多态性是否与提高OTU水平的稳定性有关。为此，我们根据其组成ASV的丰度计算了OTU的有效微多态性。考虑到多样性、持久性和可变性方面的影响，OTU被稀疏到5000个计数。作者发现，具有两种或两种以上有效ASV的OTUs更持久（出现在样品中的比例更大）和更少的变异（在不同样品中显示出更恒定的丰度）（图5，Welch’s t-test, P < 0.001）。总的来说，随着微多态性的增加，持久性增加，变异性降低（线性模型P分别为0.038、0.030），尽管OTU限于特定的湖层组合，但仍然可以显示出大量有效的ASVs（图S6）。
图5 微多态性对OTU持久性(上)和变异性(下)的影响。
图S6 有效微多态性最高的三种OTUs的生境分布。
5 环境因素驱动着微多态性的产生
微多态性是否对特定的环境梯度作出响应。为了验证这一点，作者使用增强回归树模拟了最稳定的OTU(持久性> 0.75，变异性< 2)及其组成ASVs在不同样品间的分布，并将其作为湖泊、年份、月份、深度、温度和溶解氧浓度的函数。我们模型的中值交叉验证相关系数为0.79，表明利用现有的参数可以合理地模拟这些湖泊中OTUs和ASVs的相对丰度。然后，我们比较了不同环境参数对OTU和ASV模型的贡献(图S7)。温度和氧浓度对ASV个体分布的影响显著高于对其亲本OTU分布的影响（Welch’s t-test，P分别为0.041和0.014），这表明微多态性对温度和氧气梯度的响应是这些淡水湖泊中的一般现象。
图S7 环境因素对最稳定OTUs及其组成ASVs分布的影响。
6 淡水模式群落的动态
为了确定样品中存在的类群之间的潜在联系，我们进一步关注了由Garcia等(2015)确定的淡水模式群落的代表。这个群落最初是由双季对流混合型湖泊Grosse Fuchskuhle丰富而成，由淡水中常见的四种生物（多核杆菌PnecC、两种不同的放线菌和一种拟杆菌）组成，它们可能通过建立互利的代谢相互作用在混合培养中生长(图6a)。尽管每种菌株都有不同的营养缺陷来排除无菌分离，但随着时间的推移，该菌群是稳定的，从而揭示了自然微生物群落中强大的共生模式。然而，正如作者所指出的，混合培养提供的关于系统在不断变化的环境条件下如何进化的信息是有限的。因此，我们试图在数据集中识别该模式群落的成员，并描述其随时间变化的动态。
图6 在淡水生态系统中，微多态性提供了跨环境梯度的群落稳定性。
在这四个成员中，多核杆菌PnecC、放线杆菌acI-B2和一种来自噬菌体科/杆菌科的拟杆菌具有较高的相对丰度，尤其是在夏季。相反，放线菌acIII在几乎所有的样品中或者不存在，或者含量很低。这可能是由于acIII在室内培养环境中比在野外环境中更容易生长，或者Grosse Fuchskuhle湖和本研究分析的湖泊之间存在差异。最近有人提出，自由生活的淡水细菌建立混杂而非特定的相互作用，通过与它们遇到的任何合适的伙伴联系来满足自身的代谢需求。因此，acIII的生态作用可能是由不同湖泊中的不同微生物来完成的。
PnecC，acI-B2和bacI进化枝在数据集中由多种ASVs表示，每种ASV的相对丰度主要受温度和氧气控制。图6b显示了每个进化枝和每个双季对流混合型湖泊中最丰富的ASVs，以及它们的温度和氧气偏好。这两个参数均显著解释了本研究三个双季对流混合型湖泊中同一枝系不同ASV的丰度比（图6c，FDR <0.05），以及大多数其它湖泊的丰度比（图S8和S9）。在大多数情况下，生态型似乎随着温度和氧气浓度而变化，这在数据中显著相关。唯一的例外是NSB中的进化杆菌的两种主要生态型（取决于氧气，但不依赖于温度）和SSB中的进化枝acI-B2（取决于温度，但不依赖于氧气）。之前已经报道了同一物种生态型中生态位划分的存在，我们的结果表明这种现象可能在淡水生态系统中普遍存在。
图S8 所有湖泊样品中模式群落的低温/氧(LTO)与高温/氧(HTO)生态型的相对丰度，作为水温的函数绘制。
图S9 所有湖泊样品中模式群落的低温/氧(LTO)与高温/氧(HTO)生态型的相对丰度，作为溶解氧浓度的函数绘制。
讨论
作者采用140 bp 16S rRNA扩增子研究了8个不同特征的温带湖泊的微生物群落组成，并在97％-OTU和ASV（单核苷酸差异，99.3％相似性）水平上进行了分析。我们注意到，ASVs仅代表在给定研究中可达到的最大分类分辨率，在某些情况下，这可能不足以区分密切相关的类群。例如，Hoetzinger等（2019）报道了两种不同的多核杆菌属。尽管如此，结果中的ASVs在空间、时间和环境梯度上显示出一致的分布，这表明，虽然使用更长的序列或额外的分类标记可以揭示更精细的多样性，但是分类分辨率足以产生具有生态意义的结果。
我们首先关注的是评估OTUs和ASVs是否对淡水湖泊的组成动态提供了不同的观点。排序分析结果表明，OTU和ASV分辨率在解释样品的总体组成趋势方面具有很好的一致性（图1），说明群落结构至少部分地在ASV水平以上确定。这与之前关于ASVs和OTUs的报道非常吻合，它们揭示了类似的大规模生态结果。来自同一湖泊的不同年份的样品聚集在一起(图1)，表明每个湖泊都有一个独特的成分特征，并随着时间的推移保持相对稳定。
尽管如此，在连续多年采样的四个湖泊中，均存在着很高的OTU周转率（图2），虽然可以观察到季节性模式，但在一年之后，这些群落没有恢复到原始组成。淡水微生物群落由代谢流线型微生物组成，这些微生物通过与各种可能的合作伙伴的混杂补充而茁壮成长。这种多功能性应该导致成分流动的微生物群落，其可能保持健壮，但不一定显示出强烈的季节性趋势。
例如，NSB湖泊在2007年和2008年都出现了与秋季混合相关的大量繁殖，其中涉及两种不同的甲烷氧化菌OTU（图4b）。它们各自的暴发增长很可能响应相同的潜在环境触发因素（混合事件期间低浓度甲烷和表浅浓度氧气的组合可用性），并对生态系统产生了类似的影响(与甲烷消耗相关的短暂氧气消耗，图S5)。从这个意义上说，即使群落组成逐年变化，相关的功能转换也可能会小得多。
尽管群落组成存在年际差异，但在所有群落和热层中都发现了一些类群。当作者关注数据集中相对丰度最高的八个OTUs时，发现它们由不同的ASVs组成，似乎对特定的湖泊和热层有特定的偏好（图3和图S3）。这暗示了微多态性在湖泊微生物群落动态中的重要作用。虽然OTUs和ASVs确实对群落结构提供了类似的群落结构概述（图1），但某些生态系统过程可能由特定生态型的存在和相互作用决定，而这只能通过描绘ASVs来区分。
一些研究已经描述了不同环境中微生物物种的生态型的存在，包括与宿主相关的微生物组、颗粒生物膜、沼泽、海洋、石油泄漏和淡水湖泊。此外，丰富的生物多样性也证了细菌种群的长期维持。然而，微多态性作为微生物群落稳定力量的作用仍然没有得到充分的探索。在这项研究中，在面对环境变化时，微多态性对于维持较高阶的群落组成似乎是至关重要的。有更多ASVs的OTUs比只有一个或几个ASVs的OTUs更稳定，表现出更高的持久性和更低的变异性(图5)。最近的一项工作中，Needham等（2017）报道了海洋类群持久性方面的类似趋势，并假设微多态性可以提供针对病毒的防御和底物方面的灵活性。在作者的研究中，温度和氧气是ASV分布的更好预测因子，而不是其亲本OTU的分布（图S7），这表明两种环境因素都可能推动微多态性的产生。事实上，在研究样品中一个模式群落的类群动态时，作者发现三个最普遍的淡水分支（多核杆菌PnecC、放线杆菌acI-B2和拟杆菌bacI）分别由两种主要的生态型为代表，它们在不同的温度和氧气条件下占主导地位（图6c、图S8和图S9）。除此之外，本研究中未分析的其它变量（如pH值或营养元素可用性）也可能会影响淡水湖的微多态性，从而产生一系列密切相关的菌株，每种菌株都针对特定的生态位进行了优化。
研究结果表明，微多态性是决定群落稳定性的一个重要因素：随着时间（季节性模式）和空间（热层）的波动可能会影响不同生态型之间的比例，但群落中的OTU全年均可以检测到。这在图4a中举例说明，其中，除了秋季混合事件期间其它分类群的大量繁殖外，2007和2008年两个热层中多核杆菌PnecC的相对丰度相当稳定。由于存在两种分化良好的PnecC生态型（ASV-1和ASV-2），这种稳定性是可能的，当环境条件发生变化时，它们相互替代。特别是ASV-1，其大部分是在深水层（图3和4a）中观察到的，在早春时期的地震中占主导地位，那里的温度较低，热反转仍然存在。一般来说，很难区分温度和氧气的影响，因为大多数样品是在夏季采集的，那里的水比在更深处的地方更热，表面的含氧量也更高。然而，在早春，温度和氧气浓度遵循相反的趋势（图S5）。因此，这两种生态型的多核杆菌PnecC在这一时期的动态表明，它们的丰度可能由温度而不是氧气浓度控制。这与越来越多的文献一致，强调温度在塑造微生物生态系统中的关键作用，特别是控制多核细菌生态型的分布。然而，其它作者指出氧气是推动多核细菌多样性的主要因素。这些选择不是相互排斥的，而且在不同的条件下都能增加多核杆菌的持久性。
ASV的解析还提供了对OTUs周期性暴发增长行为的新见解。Gammaproteobacteria gamI属于甲烷氧化菌属，在2007年秋季混合时暴发，直到春季混合时仍保持较高的丰度，在夏季分层时下降到非常低的丰度(图4b)。这种甲烷氧化菌在NSB中实际上由两种不同的ASVs表示：ASV-3和ASV-31。ASV-31只是在秋季混合开始时才大量存在，此时夏季深水层中积累的甲烷突然与整个水柱中的氧气混合。在这一点上，我们观察到氧浓度急剧下降(图S5)，这是由于ASV-31快速氧化了甲烷所致。另一方面，当氧浓度恢复到较高水平时，ASV-3随后占据主导地位(图4b和图S5)。
假设这两种ASV代表两种生态类型的甲基杆菌，当甲烷过量时，ASV-31可用于竞争氧气，ASV-3适合低甲烷/高氧情况。这与已知存在的具有不同氧偏好的甲基杆菌群是一致的，其中一些可以在不可检测的氧气浓度下生存。有趣的是，在2008年秋季的混合中，不同的甲烷氧化菌OTU（Methyloparacoccus，ASV-50）几乎同时暴发增长（图4b）。这些数据指向一个双重功能冗余：有两个OTU在不同年份的秋季混合后进行产甲烷和暴发，以及至少两个在Gammaproteobacteria gamI内具有不同时间动态的ASV。
为了简单起见，假设来自同一个OTU的生态型在功能上是等效的，它们在样品中的相对丰度仅受环境因素的控制。观察到的群落组成趋势与这一基本模式一致（图6c），虽然本研究提出了样品的分类特征而不是功能特征，但作者认为有理由假设系统发育密切的有机体将具有相似的功能特征。如果对于本研究中检测到的类群确实如此，作者的观察将很好地适应功能冗余的情景，微多态性保证了更高的分类等级的持久性，从而保证了跨环境梯度的功能稳定性。
淡水湖泊是一个复杂的生态系统，拥有高度多样性的微生物群落，在全球生物地球化学循环中发挥着重要作用。它们也是研究细菌群落动态变化的良好对象，因为它们在环境条件下经历季节性变化，受到周期性扰动（混合），并且含有强烈的环境梯度（分层）。传统上认为湖泊在群落组成方面表现出高度的季节性模式，尽管一些多年的研究部分地挑战了这一观点，尤其是在夏季。湖泊微生物群落在短时间尺度上也表现出变异性，对高频/高位置扰动敏感，例如风速变化。在这种不可预测的条件下，适应性对湖泊栖息微生物来说具有重要意义。正如最近报道的，在不断变化的生物景观中，建立混杂代谢互补的能力可能是一种最大限度地提高生存率的方法。在这里，表明微多态性是导致普遍存在的淡水类群持久存在的另一个因素，在这种情况下，淡水类群跨越了非生物梯度。因此，微多态性的产生可能是促进微生物群落稳定性的关键过程。虽然主要作者关注的是同一OTU的生态型之间的二分法关系，但将来可能会解开更复杂的动态变化。
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