三大基因编辑技术PK及市场分析，CRISPR技术易产生脱靶效应仍是重要隐患
纵观基因编辑技术市场，其现状与八十年代索尼公司出产的Betamax录像机和JVC公司的VHS录像机之间的磁带格式战争非常相似。在当时虽然大多数专家都认为Betamax录像机更功能丰富、性能更好且更耐用，但是从另一方面来看，VHS录像机的价格更偏宜，并且适用于长时间观影，因此在这场战役中最终的赢家是JV公司的VHS录像机。医疗市场分析公司Kalorama对基因编辑技术和公司进行梳理，动脉网（微信：vcbeat）为你做了编译和整理。基因编辑技术目前正在面临索尼和JVC公司式的困境。在基因编辑领域，很多年前就已经出现了包括基于锌指核酸内切酶和TAL效应因子在内的精准有效的基因编辑技术。但是在操作简单、成本较低的CRISPR技术的出现以后，才真正的驱动基因编辑技术市场的发展，或者说是因CRISPR技术的出现才真正的建立了基因编辑技术市场。基因组编辑是通过在基因组中特定的靶点引入功能蛋白来修饰特定生物DNA的过程。“编辑”这个词其实并不够完全，它确实概括了整个过程，但是可能错过了一些重要的步骤。比如一旦功能蛋白被引入基因组，它就成为了自身编辑的有机体，同时还可以刺激引发细胞的修复机制，使得基因失活或是在基因组的特定靶点引入新的目的基因。基因编辑技术在许多领域中具有许多商业应用价值，例如人类健康疗法、植物新品种、动物新品种、用于科学研究的动物模型、新的化合物以及能量来源的开发。目前已经处于开发阶段的各种基于基因编辑的项目实例包括：HIV / AIDS治疗、抗除草剂的芸苔植物的开发、急性淋巴细胞白血病的治疗、基因工程化大豆的开发，甚至还有基于基因编辑的巴马猪和啮齿动物模型。目前，很多公司都表现出了对于基因编辑技术市场的兴趣。MilliporeSigma、Thermo Fisher Scientific、Dharmacon、GeneCopoeia、GenScript、Horizon Discovery Group、OriGene、Transposagen、ToolGen是基因编辑技术市场的主要参与者。
基因编辑市场逐年递增(工具、试剂、服务、供应) 单位：金额/百万美元 2014 – 2016.医疗市场分析公司Kalorama信息预估，在基因编辑技术市场中基因编辑工具、试剂、服务、模型和其他与该技术相关的用品占有了约6.08亿美元的市场份额，相比2014年时的2.33亿美元有所增长，并且随着新应用的开发和新项目的增加，预计在未来五年将会实现快速增长。使用基因编辑技术的治疗学和农业应用的不断发展，以及公共和私人在基因编辑领域投资的增加也将驱动该市场的不断向前。目前，大量公共和私人投资者都对使用基因编辑技术发展人类健康疗法领域表现出了很大的兴趣。Bayer，Biogen，Juno Therapeutics，Novartis，Pfizer和Regeneron Pharmaceuticals等公司通过与小公司的各种投资和合作，参与使用基因编辑技术开发治疗药物。除了人类治疗的发展之外，基因编辑技术在许多其它领域中具有商业应用，其中许多领域刚刚开始被探索。事实上，我们已经掌握了多种基因编辑技术。第一个引入的是锌指核酸酶技术，或称ZFN。它的靶向效率为其赢得“分子剪刀”了的称号。它已经成为一项完善的技术，已经在从人类到其他多个生物模型得到了应用，如果蝇、拟南芥、斑马鱼、小鼠、大鼠，是一项经过验证的得到公认的技术。锌指核酸酶技术具有很高的特异性的，因此不会引起免疫应答，但是这种高度的特异性将会产生消极的影响，即基因工程化锌指DNA结合蛋白成为了一个难题，部分也是由于蛋白质本身体积庞大的性质及其环境依赖性结合的属性。除此之外，它们还易于脱靶，导致可以细胞被杀死或发生计划外的突变。TALEN作为第二代基因组编辑核酸酶被引入，与其它技术相比，其能更大程度上的地避免功能蛋白脱靶。与锌指核酸酶相比，TALEN使用起来更简单、构建更迅速，并且价格更低廉。TALEN不像ZFN那样容易受周围连接环境绑定的影响，因此与ZFN相比，其设计和工程没有ZFN复杂。与此同时，由于它们具有与DNA靶位点结合的高度特异性，因此比其它工具酶，TALEN产生的脱靶效应非常微弱。但是装配TALEN编码质粒却是一个冗长的、高强度工作的过程。CRISPR-Cas9技术是在对细菌的免疫系统进行研究时研究开发出来的。在细菌的免疫系统中，其防御机制可使用DNA片段来对抗病毒等外来物质。科学家们认为，如果细菌的自身环境足够好，那为什么不开发一种技术以同样的方式来对外来物质进行干预？CRISPR序列由众多短而保守的重复序列（重复区repeats）和间隔区（spacer）组成。间隔区是一些可变序列，其与先前入侵细菌基因组外的外源遗传物质的序列相对应。这些间隔序列储存在细菌基因组内，被看作是通过再感染来触发降解入侵病毒DNA的记忆机制。距离该理论被提出已经过去了几十年，但是直到2012年，用于这项技术的工具才上市。在CRISPR技术中，首先CRISPR序列转录为单个RNA，然后被加工成较短的CRISPR RNA（crRNA），其具有引导Cas酶的活性以降解靶向核酸的作用。 每个“向导RNA”都可识别其自身靶序列并引导Cas9酶对DNA链进行切割，从而刺激细胞的NHEJ或HDR修复机制。CRISPR-Cas9技术的工具使用起来非常简单，同时其设计和构建速度最快，成本也最低。由于不涉及蛋白质工程，所以构建CRISPR-Cas9技术的工具只需要几天时间就可完成，成本可以控制在几百美元的范围内。因此，开发大量短向导RNA相对容易，其在高通量应用如功能基因组学研究中也具有广泛的应用。CRISPR-Cas9工具只需通过对向导RNA序列进行简单的修饰，就能轻松重定向到基因组中的几乎任何位置。同时，由于其拥有多重的基因编辑能力，与传统育种技术相比较，也可以让用于复杂疾病研究的动物模型的更快速、成本更低廉的工程化。但是CRISPR-Cas9技术也有一些限制，包括被看作ZFN限制的功能蛋白脱靶。与ZFN和TALEN复杂的二聚体结构相反，CRISPR-Cas9系统拥有更简单的单体结构，可通过碱基配对结合同源位点，因此在结合和切割期望的DNA位点方面特异性较低。而且对于CRISPR-Cas9技术来说，脱靶突变验证难度增加，并且需要对具有相似同源性的所有位点的突变都进行广泛的全基因组扫描，这将是很大的工作量。科学家们已经研究出了各种可增加特异性和消除脱靶效应的策略，包括利用不同细菌来源的酶、重组Cas9酶，以及对向导RNA中识别序列的长度和二级结构的做出一定的改变。最近，在2015年9月，科学家在弗朗西斯细菌中发现了非Cas9 CRISPR系统即CRISPR-Cpf1，其在解决这一领域的问题上拥有其独特的优势。ZFN、TAFEN、CRISPER-Cas9三种技术比较技术优势限制ZFN免疫原性低在体内体外易于传输人类基因编辑最确立的技术蛋白工程与重靶向困难脱靶编辑价格昂贵多样化困难TAFEN高度特异性在体外易于传输与ZFN相比更简单、低廉多样化且高通量构建和重靶向过程冗长脱靶编辑多样化困难CRISPER-Cas9多样化且高通量重靶向简单价格经济与ZFN、TAFEN相比特异性低体外传输过程复杂脱靶编辑尽管与其他基因编辑技术工具的优势相比，由于CRISPR-Cas9技术较新，因此其治疗学方面的发展明显落后于其他基因编辑技术。并且目前还不清楚CRISPR技术在未来是否能被证明适用于人类健康治疗。就目前看来，其易产生脱靶效应仍是一项重大的挑战，如果克服了这一难题，那么CRISPR技术用于人类治疗的安全性就能得到很大的提高。由此我们可以知道，在保持CRISPR技术优势的基础上，努力突破其限制壁垒将是未来几年基因编辑技术发展的大趋势。
长按图片报名2016未来医疗100强榜单重磅发布「推荐阅读」