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今天和大家分享的是2020年2月发表在Cancers（Basel）（IF：6.126)上的一篇文章，“Genomic Signature of the Standardized Uptake Value in 18F-Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography in Breast Cancer”。本文通过对3710例BRC（乳腺癌）患者进行综合基因分析，确定了SUV signature，该signature对预测BRC患者的预后和治疗有重要意义。对SUV，突变和基因表达变化的综合研究表明，高SUV患者对ICIs治疗有反应。通过对BRC细胞系在转录和蛋白质水平上的实验分析，作者还证实了致癌转录因子和代谢相关基因与SUV之间的相互作用。
Genomic Signature of the Standardized Uptake Value in 18F-Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography in Breast Cancer
乳腺癌中18F-氟脱氧葡萄糖PET-CT显像中SUV的基因组signature
一、 研究背景
SUV（标准化摄取值）表示FDG-PET中葡萄糖的摄取程度，是已知的预后预测因子。研究表明葡萄糖代谢在恶性肿瘤的发展中有很重要的作用。因此，了解糖酵解与FDG-PET在恶性肿瘤中的关联可能为BRC提供新的靶向代谢的治疗选择。
二、 分析流程
三、 结果解读
1. 转录组数据分析反应BRC患者的SUV变化
作者在Table1中列出了该研究中所用的3710例患者的基线数据。作者首先对YSU队列进行基因表达谱的分析。通过皮尔森相关检验获得SUV相关的基因集（1424个基因），对此基因集进行层次聚类分析，将BRC患者分为SHC（SUV高簇）和SLC（SUV低簇）。作者通过费舍尔精确检验，比较根据SHC/SLC以及SUV cut-off值（SUV≤4 或 >4）这两种标准划分患者，观察到BRC患者的分类情况显著相似，且两种分类对疾病复发的估计没有差异，表明SUV相关基因可以反应SUV的预后特征。
通过研究这1424个基因的表达模式，作者观察到细胞周期，胞质分裂和DNA修复相关的基因在SHC中表达更高。
为了验证SUV相关基因的表达模式，作者将1424个基因应用于YSU-TNBC队列中的表达数据，进行层次聚类分析显示根据该SUV相关基因分类患者和SUV值分类患者显著相似，与YSU队列的研究成果一致。
同时作者也在YSU-TNBC队列中得到了一个SUV相关的基因集，将此基因集与在YSU队列中得到的相关基因集相交，得到229个基因。
Table1：BRC患者的基线数据
迄今为止，用于BRC患者分类的SUV cut-off值尚未标准化。由于SUV相关的基因反应了SUV的预后特征，作者试图确定与SUV相关基因表达改变对应的SUV阈值。在图1A和B中，作者展示了对1424个基因以及229个基因进行层次聚类对应SUV的cut-off值，均为4.6。这可能是SUV的潜在分层标准。
图1A和B：YSU队列中的SUV值和SUV相关基因表达模式的比较
在DNA修复相关的基因中，FOXM1的mRNA表达水平与SUV密切相关，是两个风险亚组的最高判别因子。为了验证这一结论，作者在YSU-FFPE队列中评估了FOXM1的mRNA和蛋白质表达水平。如图1C所示，FOXMI在高SUV患者中高表达，这表明FOXMI是预测SUV的关键因子。
图1C：YSU-FFPE队列验证FOXM1的mRNA和蛋白质表达水平。
2. SUV相关基因的生物学认识
首先，对SUV相关的1424个基因进行了功能富集分析。结果表明，与癌症，细胞周期和组织发育有关的基因被高度富集。同时，作者发现大量基因参与DNA的复制重组和修复。这表明DNA的异常修复与BRC的SHC患者的不良预后有关。
为了确定与SUV相关的主要调控因子，作者对SUV相关基因进行了上游调控因子分析。结果显示出重要的激活或抑制调控因子，其中最强的激活因子是FOXM1。在这些上游调控因子中，作者找到了与SUV亚组相关的信号轴：FOXM1-AURKB-CDKN1A。其中，FOXM1和AURKB的表达水平在SHC中显著高于SLC，这提示了FOXM1-AURKB信号通路可能是SHC患者预后不良的关键因素。对于CDKN1A，尽管它调控的基因网络与SUV亚群显著相关，但未观察到CDKNIA的表达与SUV亚组之间的关联。
作者还进行了调控效应分析，以评估上游调控因子及其作用因子显著激活了哪一些生物功能。结果表明，与SUV相关的调控因子展示出了top的调节剂作用，激活了肿瘤细胞中几个细胞周期阶段的胞质分裂和失调。这些基因在SHC中显著高表达，提示SUV具有强大的生物学特征，与FOXM1以及其他重要的调控因子协同激活下游效应子的生物学机制相适应，随后导致胞质分裂或细胞周期失调。
3. SUV signature与预后
先前的研究表明，SUV在预测患者预后具有重要意义。作者接下来鉴定分子signature，并使用该signature来验证其在BRC患者中的预后相关性。
分层聚类分析根据SUV相关基因将患者分为SLC和SHC，进行KM生存分析。图2A和B可见，YSU队列中，SHC患者的DFS和癌症特异性生存率均显著低于SLC患者。同时作者还利用来自UNC队列（C），TCGA队列和METABRIC队列（D）的患者进行验证，结论与先前一致。
图2：SUV signature亚组的KM生存分析
为了进一步评估SUV-signature的预后独立性，作者结合了YSU和UNC队列的数据，结合临床病理学的风险因素，进行了COX回归分析（Table2）。结果可见SUV signature对BRC的复发预测具有统计学意义。作者还对METABRIC队列进行了分析，结果证实该signature预测BRC患者的DFS稳健。上述分析表明SUV signature具有独立的临床意义。
Table2：对BRC患者的DFS进行单因素和多因素COX回归
4. BRC中SUV基因组亚型的变异概况
作者接下来探究TCGA队列中SUV signature相关的体细胞突变。可见SHC中的TMB显著高于SLC（图3A）。然后，在所有BRC中选择了突变频率>1％的基因。图3B展示了在TCGA队列中，SHC和SLC之间的致癌 signature中的4个基因和代谢通路中的10个基因具有显着不同的突变率，其中TP53是SUV亚组之间的最高判别因子，其在SHC中的突变频率显着高于SLC；而PIK3CA则是SUV亚组的另一个重要判别因子，其在SHC中的突变频率显着低于SLC。
同时，补充材料中还展示了，作者在比较METABRIC队列中SLC和SHC之间的突变方式时，验证了SUV亚型之间TP53和PIK3CA的互斥突变模式，与TCGA队列的结果一致。
图3A-B：SUV亚组与BRC核心分子特征之间的关联
作者还比较了已知的分子和组织学亚型与SUV signature展现的体细胞突变（图3C）。
SHC患者中ER和PR阴性的频率更高；
突变型TP53，野生型PIK3CA患者的ER或PR阴性状态发生率更高。
HER2的状态在SUV亚组之间模糊不清，因此作者根据HER2状态对BRC进行重新分组。在每一个HER2亚组中都将SLC和SHC明确的分开了，且其中还可以观察到互斥的TP53和PIK3CA突变模式以及SHC中ER阴性样本的富集。
同时，在图3C中可见，SHC中TNBC患者的发生率显着高于SLC，表明SHC患者的预后较差。且绝大多数TNBC患者都是TP53突变和PIK3CA野生型。对于组织学分型，大多数浸润性小叶癌患者属于SLC亚型，SHC亚型中大多为浸润性导管癌，而许多基底型的BRC患者也属于SHC亚型。
图3C-D：SUV亚组与BRC核心分子特征之间的关联（左列为SLC，右列为SHC）
5. SUV signature与对ICI反应的关联
由于TMB是预测ICI（免疫检查点抑制剂）反应的有效的生物标志物，且SUV亚组之间的TMB有显着差异，因此作者试图确定SUV signature对ICI治疗反应的预测价值。同时，对免疫检查点基因的表达水平研究发现，除了PD-L1（CD274）外，SUV亚型之间的表达差异很大。
另外，由于DNA损伤应答和修复（DDR）基因的激活与ICI应答显着相关，因此，作者还估计了DDR基因的表达水平，证实了SHC患者的DDR基因高表达。DDR基因高表达的规律还出现在突变型TP53和野生型PIK3CA的BRC患者中，这暗示互斥TP53和PIK3CA对ICI的预测价值。
在SHC亚组中，TGFβ通路基因被显着下调，上皮-间质转化（EMT）基因在基因表达上也有差异。这个结论与已知的TGFβ减弱了患者对ICI的反应的结论一致。
目前为止，在基因组水平尚无ICI反应性数据，作者验证了SUV signature对ICI（阿托珠单抗，PD-L1）在尿路上皮癌（UC）的治疗预测价值。当在UC队列中使用BRC的SUV signature，发现SHC亚组的ICI反应率显著高于SLC，表明SHC患者可选用ICI治疗。
6. FOXM1-LDHA信号通路介导的SUV signature的实验表征
通过观察与SUV signature相关的致癌或代谢通路的基因，作者试图确定FOXM1的上游调节因子及下游效应因子。重新检测显著突变基因与SUV signature，发现TP53的上游网络显著过表达。TP53形成了一个主要的中心基因网络，与以FOXM1为中心的基因网络相连接。许多代谢相关的基因受到TP53的调控，其中LDHA还受到FOXM1的调控，与糖酵解-糖异生有关。糖酵解-糖异生基因的表达水平在SUV亚组之间有显著差异。
与FOXM1表达相似（图1C），在蛋白质水平评估接受术前FDG-PET检查的YSU-FPE队列中的FPE组织，证实高SUV患者的pLDHA细胞质染色高于低SUV人群。上述结果表明，SUV还反映了由TP53和FOXM1调节的葡萄糖代谢。
接下来作者使用FOXM1和LDHA进行了体外实验，来验证SUV signature以支持FOXM1调节的葡萄糖代谢。将SUV Signature应用于52个BRC细胞系，作者鉴定出两个BRC细胞系进行进一步研究。进一步估计FOXM1和LDHA的mRNA和蛋白水平，作者选择MDA-MB231和BT549作为SHC细胞系，T47D和ZR75-1作为SLC细胞系（图4A）。
图4A：BRC细胞系的FOXM1和LDHA的mRNA和蛋白水平
使用pFOXM1转染SLC细胞系时，FOXM1，LDHA的mRNA和蛋白水平以及LDHA的磷酸化水平均升高；使用siFOXM1转染SHC细胞系时，LDHA和pLDHA的水平降低了（图4B）。
作者还进行了乳酸和葡萄糖摄取测定，以研究FOXM1表达是否与BRC细胞中的乳酸产生、LDHA活性和葡萄糖利用率有关。结果显示FOXM1过表达增加了SLC细胞中的葡萄糖利用率和乳酸的产生，而相反，在siFOXM1转染的SHC细胞中，葡萄糖利用水平和乳酸生成水平降低（图4C）。这些结果表明，FOXM1转录调节BRC中的LDHA的表达，这表明SHC的侵袭性可能通过激活FOXM1-LDHA信号通路来调节。
图4B-C：FOXMI调节BRC细胞中LDHA的表达，葡萄糖利用和乳酸的产生。
小结
作者确定了一个基因组signature，揭示了从FDG-PET扫描获得的BRC患者与SUV相关的亚型。在临床方面，作者还评估了SUV signature对预后和ICI反应性的关系。本研究还揭示了葡萄糖摄取的基因组和代谢组学特征，进一步理解了葡萄糖代谢，并支持高SUV的BRC患者的不良预后。尽管该研究的数据揭示了SUV signature的重要性，但仍需进行进一步的验证研究，以鉴定易于评估的生物标记物，该生物标记物由稳健提示SUV的小基因集组成。