Journal of proteome research|细胞代谢组学通过调节柠檬酸盐代谢揭示小檗碱...
胰腺癌 (Pancreatic Cancer，PC) 正成为最致命的癌症之一，由于其致病潜伏期和临床上缺乏有效的药物，其死亡率位居世界前列。考虑到癌细胞以大量代谢成本进行增殖和分化，如糖酵解失调和线粒体损伤诱导的异常 TCA 循环所示，Jingjing Liu等人使用细胞代谢组学方法研究了小檗碱 (BBR) 在胰腺癌中的治疗能力，并发现柠檬酸可能成为药物开发和治疗 PC 的新靶点（但后续还需要进一步的实验验证）；同时，本研究表明，细胞代谢组学方法与快速探索天然产物生化功能的能力有关。
关键词：胰腺癌；小檗碱；细胞代谢组学；柠檬酸代谢；线粒体损伤；细胞增殖和转移；脂肪酸生物合成
原名：Cell Metabolomics Reveals Berberine-Inhibited Pancreatic Cancer Cell Viability and Metastasis by Regulating Citrate Metabolism
译名：细胞代谢组学通过调节柠檬酸盐代谢揭示小檗碱抑制的胰腺癌细胞活力与转移
期刊：Journal of proteome research（中科院分区：生物大类2区；生化研究方法小类2区；JCR分区为Q2区）
IF:4.466
发表时间：2020年7月21日
通讯作者&通讯作者单位：
DOI:10.1021/acs.jproteome.0c00394
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.0c00394
1.小檗碱显著抑制 PC 细胞活力和转移
由于先前已有研究报道小檗碱通过产生 ROS36 引起的 DNA 损伤诱导 PC 细胞凋亡。因此，作者研究了小檗碱对 PC 细胞凋亡和转移的抑制作用。 CCK-8测定结果表明，当处理浓度高于1μM时，72小时后小檗碱明显抑制PC细胞活力（图2A）。
此外，膜联蛋白 V(FITC)/碘化丙啶 (PI) 的荧光激活细胞分选 (FACS) 分析表明，小檗碱确实显着促进了 PC 细胞凋亡，这显然取决于处理浓度（图 2B）。总之，本次研究数据表明小檗碱能够显着降低 Panc-1 PC 细胞的细胞活力并启动细胞凋亡。
最初，作者发现在治疗的最初 48 小时内，小檗碱确实微弱地抑制了 PC 细胞增殖；因此，在 48 小时时，验证了 BBR 可以抑制细胞迁移。正如 Transwell 测定数据所示，通过膜迁移的细胞数量显着减少，这意味着小檗碱显着抑制了 PC 细胞转移（图 3）。总之，小檗碱是一种潜在的抗癌化合物，不仅可以触发胰腺癌细胞凋亡，还可以抑制癌细胞增殖和转移。
2.BBR负调节细胞因子和癌基因的表达以灭活PC细胞增殖
为了探索 BBR 对 PC 的抗肿瘤能力，作者进行了酶联免疫吸附试验 (ELISA)，以确定响应 BBR 治疗的肿瘤坏死因子α (TNFα)和 CA242 的表达（图 4A 和 B）。结果表明，BBR 大大降低了 LPS（脂多糖）激活的 TNFα 水平。 LPS 激活的 PC 细胞 CA242 被 BBR 降低，这证明了 BBR 对 PC 的治疗潜力。
最后，作者分析了RNA测序结果，共检测到7368个基因，其中3726个基因下调，3642个基因上调（图S1）。
有趣的是，作者发现 BBR 治疗显着降低了致癌基因 Kras 的表达水平，这表明 PC 进展受到显着干扰。 BBR治疗后CDKN2A的表达显着增加，表明肿瘤细胞被精确抑制。总之，本次研究数据证实了 BBR 可以调节癌基因 Kras 和肿瘤抑制因子 CDKN2A 的表达以灭活 PC 细胞生长（图 5A 和 B）。
3.小檗碱显著失调胰腺癌细胞的代谢
作者使用课题组新开发的靶向代谢组学方法来准确识别代谢改变，发现用小檗碱处理后，PC 细胞代谢发生显著变化，大多数靶向代谢物上调。吉西他滨是临床上用于治疗胰腺癌的专利药物，但其有效性尚不清楚（因为它经常表现出高频耐药性）。代谢组学分析表明，小檗碱和吉西他滨显着调节 PC 细胞代谢并具有相同的调节模式；然而，BBR 对细胞代谢产生了更强的影响（图 6A 和 S2）。
通过将 PC 细胞暴露于不同浓度的 BBR，发现细胞代谢的表型变化明显取决于 BBR 的处理浓度（图 6B 和 S3）。
一般而言，BBR 处理后大多数氨基酸和核苷酸上调，表明细胞代谢活性大大增强。有趣的是，除了它们在其他癌症中的水平外，BBR 显著增加了能量代谢（糖酵解和谷氨酰胺）相关代谢物的水平，BBR 下调了 TCA 循环相关代谢物（图 7 和图 S4）。
这些结果表明线粒体结构可能被 BBR 破坏，这大大影响了 TCA 循环的活性。正如预期的那样，我们的成像分析证实 BBR 可以显着破坏 PC 细胞线粒体（图 8）。因此，我们提出 BBR 可以通过能量代谢失调和线粒体损伤来抑制细胞转移，并触发 PC 细胞的凋亡。
4.柠檬酸盐是抑制胰腺癌细胞的关键代谢物靶点
BBR增殖和转移小分子代谢物是酶调控生物合成的关键底物和产物，其表达受代谢基因的进一步调控；因此，代谢物、酶和基因之间的相互作用涉及对感兴趣的生物事件的机制理解。
为了确定可以靶向抑制 PC 细胞增殖和转移的功能性代谢物，作者评估了 81 种受 BBR 治疗显着影响的差异代谢物，选择阈值是大于 2 的倍数变化（图 S5 和表 S3）。
作者使用相同的选择模式，鉴定了正常胰腺细胞 (hTERT) 和 Panc-1 细胞中的 86 种差异代谢物。发现了与能量代谢相关的必需代谢物柠檬酸（图 S6 和表 S4）。
数据显示，胰腺癌细胞显示更高水平的柠檬酸盐，但随后被 BBR 治疗下调（图 9A），这一发现表明柠檬酸盐可能是最重要的功能代谢物之一，可被用于治疗 PC 的 BBR 靶向细胞。
众所周知，癌症进展引发了 Warburg 效应，其中大多数癌细胞中的 TCA 循环被下调，柠檬酸的表达水平显着降低。然而，除了TCA 循环外，脂肪酸的生物合成也是受柠檬酸盐调节的重要功能，并在胰腺癌细胞增殖和转移中发挥重要作用。因此，作者推断 BBR 可以通过抑制柠檬酸盐代谢来破坏脂肪酸的生物合成。
据报道，细胞线粒体中有四种基因参与柠檬酸的表达和调控，包括柠檬酸合酶 (CS)、乌头酸酶 1/2 (ACO1/2)、线粒体柠檬酸载体 (CIC) 和 ATP 柠檬酸裂解酶 (ACLY)6666。线粒体中的 CS 可以催化乙酰辅酶 A 产生柠檬酸盐以启动 TCA 循环，并且它在胰腺癌中高度表达，为脂肪酸合成提供足够的柠檬酸盐。然而，不是BBR靶点的CS的表达在药物治疗后没有改变。 ACO1和ACO2是将柠檬酸盐转化为异柠檬酸盐的酶；然而，ACO1 位于线粒体中，ACO2 位于细胞质中。在本研究中，作者观察到 ACO1 被 BBR 下调，但 ACO2 的表达没有改变。因此，作者提出柠檬酸盐表达的降低可能归因于细胞质中发生的代谢修饰。（图 9B）。
CIC 是一种通道调节剂，可将柠檬酸盐从线粒体转运到细胞质，其表达与智人中的 SLC13A5 基因密切相关。本次研究结果表明 SLC13A5 的表达被 BBR 上调，这意味着 BBR 可以促进柠檬酸盐从细胞线粒体到细胞质的运输（图 9B）。 ACLY 是一种成熟的致癌基因，通过将柠檬酸盐转化为细胞质中的乙酰辅酶 A 和草酰乙酸盐，对脂肪酸的生物合成做出重大贡献 72-73。 BBR显着降低了ACLY的表达，导致脂肪酸代谢中断（图9B）。总之，BBR 可以通过调节 ACO1、SLC13A5 和 ACLY 来介导柠檬酸盐的定位并抑制其在细胞质中产生脂肪酸的能力（图 9C）。因此，柠檬酸盐的表达和调节可能是治疗 PC 的新靶点，而 BBR 通过调节柠檬酸盐代谢来调节脂肪酸的生物合成来提高治疗效率。
总的来说，本研究表明细胞代谢组学方法可用于快速研究天然产物的生化功能，这为 BBR 在胰腺癌中的治疗发现提供了新的见解。本研究发现，将柠檬酸盐代谢确定为治疗 PC 的新靶点，这也涉及协调针对 PC 的新药物发现和开发的能力。
/////前期回顾/////
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