得自微藻的强免疫刺激剂的制作方法

专利名称：得自微藻的强免疫刺激剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及从食品级微藻(microalgae)提取免疫刺激性多糖制品的方法。其还涉及由食品级微藻分离的结构复杂的免疫激活性水溶性多糖制品的鉴定，该制品中含有表观分子量约2百万道尔顿的活性多糖。其还涉及用本发明的制品治疗和/或预防多种病症的方法。
背景技术：
在过去的30多年中，通过使用调节免疫反应的治疗方案，免疫治疗已成为治疗人类疾病和病症的重要手段。在免疫系统受到危害的病症中，这是特别重要的。在疾病模型和临床试验中进行的研究表明增强宿主防御机理在治疗和预防微生物感染、免疫缺陷、癌症和自身免疫性疾病(1-5)中是有利的。免疫提高方案还可以用来促进伤口愈合。在伤口愈合过程中，巨噬细胞通过调节细胞增殖和新组织形成/再生而发挥主要作用。它们还作为吞噬细胞、清创剂，并产生生长因子，影响伤口修复的血管生成阶段(6)。
从历史方面来看，开发的第一种免疫刺激剂是细菌产物(溶菌产物和粗馏分)、减毒微生物或热灭活的细菌。其中包括试剂如卡介苗(BCG)、粉刺丙酸菌和脂多糖(1，2)。虽然，由于其毒性和副作用，这些制品取得了有限的成功，但是其中很多已被USDA批准用于兽医中的免疫调节(3)。由多种来源研发出其它物质，包括天然来源的、化学合成的或者用重组技术合成的。天然来源的大多数免疫刺激剂是高分子量多糖、糖蛋白或复合肽(1)。例如，由群交裂褶菌(Schizophyllum commune)(schizophyllan)、埃杜香菇(Lentinusedodes)(lentinan)和杂色革盖菌(Coriolus versicolor)(krestin)得到的三种真菌多糖目前在日本作为生物反应调节剂用于临床(4)。另外一种多糖acemannan(分离自库拉索芦荟)被美国农业部批准用于治疗狗和猫的纤维肉瘤(7)。得自天然产物的小分子量免疫刺激剂很少，如鞘糖脂KRN-7000。用KRN-7000作为免疫刺激剂治疗实体瘤的临床试验目前正在进行中(8)。合成来源的若干免疫刺激剂也得以开发，包括异丙肌苷和胞壁酰肽等化合物(2)。最近用重组技术已开发了一些内源性的其它免疫调节剂，它们已获得FDA批准。这些制品包括集落刺激因子、干扰素和重组蛋白(5)。但是，这些化合物常常是半衰期短，且难以确定最佳剂量和适当的联合用药。
虽然目前的免疫刺激剂很有前景，但是仍需要开发更强的制品并增加免疫治疗用药物的供应。可以用于寻找免疫刺激剂药物的不同化学性质的化合物的一个来源，是天然产物。几个世纪以来，天然产物已用作治疗用制品，其中很多还用于今天的临床中。天然产物作为开发药物的一种途径，是基于它们空前的分子多样性和广泛的生物活性(9)。
在古代，微藻已被用做营养品。据历史记载，在非洲Lake Chad附近的部落以及墨西哥Lake Texcoco周围生活的阿兹特克人食用微藻如钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)(10)。在最近的几十年中，人们对于人用和作为家畜饲料的食品级微藻的商业生产越来越感兴趣。因其商业潜力已被开发的多种微藻中，螺旋藻(Spirulina)类、小球藻(Chlorella)类和水华束丝藻(Aphanizomenon flos-aquae)(AFA)是三种主要的类型，它们已被成功开发，并广泛应用。
对于食品级微藻的消费的一般性报告和最近的研究，表明其提高了动物和人的免疫功能。已证明口服蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)与感染单核细胞增生利斯特氏菌的小鼠中天然杀伤细胞活性增强(11)和粒细胞-巨噬细胞祖细胞增多(12)相关。食用的钝顶螺旋藻增加了小鸡中巨噬细胞吞噬活性(13)，而螺旋藻属梭形菌属(fusiformis)给人带来了化学保护作用(14)。已报告人食用AFA后使免疫细胞运输产生变化，并使免疫监视功能提高(15)。所有这些作用中的活性成分还没有明确。
本文中研究了从微藻中分离出的多种化合物。确定得自小球藻和钝顶螺旋藻的一些多糖和糖蛋白的抗肿瘤、抗病毒和免疫刺激活性。相反，从AFA中没有分离出显示出任何生物活性的化合物。
从小球藻中已分离出多种具有生物活性的化合物。在美国专利No.4,533,548中从蛋白核小球藻分离出具有抗肿瘤和抗病毒活性的酸性多糖(16)。此多糖的糖基组成大部分是鼠李糖，其中带有少量的半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸。在美国专利4831020中报告的从海洋小球藻minutissima中分离的另一种多糖，似乎具有抑制肿瘤生长的作用。但是，其中没有有关分子量或糖基组分的报告(17)。
在美国专利4,786,496中，海洋小球藻类的脂馏分(糖脂部分)显示了抗肿瘤性质(18)。从小球藻中也分离出了若干糖蛋白。例如，美国专利4,822,612报告了45,000道尔顿的糖蛋白，其具有抗癌作用(19)。在科学文献中还已报告了多种其它糖蛋白(20-23)和甘油基糖脂(24)，它们可能具有提高免疫力和抗肿瘤性质。这些化合物都不是多糖。
从钝顶螺旋藻类中已分离出若干不同类型的具有生物活性的多糖。例如，硫酸化多糖钙spirulan抑制肿瘤侵入和转移(25)。钙spirulan(分子量74,600道尔顿)由鼠李糖(52.3％)、3-O-甲基鼠李糖(32.5％)、2，3-二-O-甲基鼠李糖(4.4％)、3-O-甲基木糖(4.8％)、糖醛酸(16.5％)和硫酸盐组成(26)。
美国专利5,585,365公开了分子量250,000至300,000道尔顿的抗病毒多糖，其是用热水提取自钝顶螺旋藻类(27)。此多糖由鼠李糖，葡萄糖，果糖，核糖，半乳糖，木糖，甘露糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。最近从钝顶螺旋藻类中分离出了一些其它低分子量多糖，它们的分子量为12,600至60,000道尔顿(28-30)。
确定免疫刺激活性的一个途经是使用巨噬细胞参与的生物试验。单核细胞/巨噬细胞发现于体内的各种组织中，它们在协调免疫反应和一些生物过程中是非常重要的(31)。在吞噬作用、免疫监视、伤口愈合、杀死微生物和肿瘤细胞以及将抗原呈递给T淋巴细胞中扮演重要角色(32)。在癌症中，巨噬细胞通过产生细胞因子和其它免疫因子介导肿瘤细胞毒性功能(33)。为了巨噬细胞在后天和先天免疫性中扮演重要角色，它们必须对环境试剂产生有效的反应，首先被激活(34)。巨噬细胞活化是通过促炎性转录因子如核因子κB(NF-κB)。此类转录因子再控制和调节介导多种免疫反应的基因组的活化/抑制。
在没有接受刺激的巨噬细胞中，NF-κB以失活的异二聚体的形式存在，其被胞质溶胶中的抑制性-κB(I-κB)蛋白封闭。引起I-κB蛋白分离并降解的试剂，使NF-κB二聚体转运至细胞核，在此它们可以激活下游基因的转录(35)。NF-κB调节的靶基因包括促炎性细胞因子、趋化因子、炎性酶、粘附分子和报告分子(36)。
在本发明中，用基于转录因子的试验检测人单核细胞中的NF-κB，来指导得自食品级微藻的免疫刺激性多糖制品的提取、分离、定性和开发。本发明的多糖与目前提供的几乎所有的其它多糖不同，它们是水溶性的，且在含水乙醇溶液中也是可溶的。

发明内容
从水华束丝藻(AFA)、蛋白核小球藻和钝顶螺旋藻中分离出了具有巨噬细胞免疫刺激活性并含有具有表观分子量约2百万道尔顿的活性多糖的新的水溶性多糖制品。本发明的多糖制品与目前用于临床进行癌症患者的免疫治疗的多糖制品相比，对于单核细胞的激活来说活性至少高出1000倍。
按照本发明的一个实施方案，从微藻中分离含有多糖的免疫刺激制品，其中所述多糖可以用含有水或者含有水和至少一种低级烷基醇的混合物的溶剂提取，其中所述低级烷基醇的烷基部分具有1至4个碳原子，且其中所述活性多糖表观分子量约2百万道尔顿以上。按照另一实施方案，免疫刺激制品的免疫刺激活性表现为单核细胞/巨噬细胞的活化。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品由微藻水华束丝藻提取。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品由微藻蛋白核小球藻提取。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品由微藻钝顶螺旋藻提取。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基组分基本上由甘露糖，葡萄糖，鼠李糖，半乳糖，岩藻糖，甲基化的糖和N-乙酰基化氨基糖组成。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基组分基本上由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖，葡萄糖和甲基化的糖组成。按照另一个实施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基组分基本上由鼠李糖，葡萄糖醛酸，岩藻糖，半乳糖和甲基化的糖组成。按照另一个实施方案，一种药物组合物含有任何一种上述免疫刺激制品和药用载体或赋形剂。按照另一个实施方案，一种食品增补剂含有任何一种上述免疫刺激制品和食品增补剂可接受的载体或赋形剂。
按照另一个实施方案，一种给需要治疗的个体提高免疫功能的方法，包括给所述个体使用有效量的药物组合物或食品增补剂。按照另一个实施方案，所述个体患有病毒，细菌或真菌感染。按照另一个实施方案，所述个体患有癌症。按照另一个实施方案，所述个体患有免疫缺陷。按照另一个实施方案，所述个体是人。按照另一个实施方案，所述个体是动物。
按照另一个实施方案，一种从富含免疫刺激多糖的食品级微藻获得制品的方法，该方法包括以下步骤(a)用含有水或水和至少一种低级烷基醇的混合物的溶剂提取此微藻制备提取物，所述烷基醇的烷基部分含1至4个碳原子，其中所述混合物的醇浓度为0-100％(体积)，提取温度为约4℃至100℃；(b)任选地将此提取物浓缩至较小的体积，其中体积大时才需要浓缩步骤；(c)通过沉淀手段将多糖制品从该提取物中沉淀出来；(d)通过分离手段分离沉淀的多糖制品；及(e)用95％乙醇洗涤(d)的沉淀物。按照另一个实施方案，为从富含免疫刺激多糖的食品级微藻中获得制品，在提取过程中所用的醇是乙醇。按照另一个实施方案，为从富含免疫刺激多糖的食品级微藻中获得制品，在提取过程中所用的醇是甲醇。按照另一个实施方案，为从富含免疫刺激多糖的食品级微藻中获得制品，在提取过程中所用的醇是异丙醇或丙醇。按照另一个实施方案，在步骤(a)中优选的醇浓度是20-80％。按照另一个实施方案，提取的优选温度是40至80℃。按照另一个实施方案，该方法用来从水华束丝藻中获得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一个实施方案，该方法用来从蛋白核小球藻中获得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一个实施方案，该方法用来从钝顶螺旋藻中获得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一个实施方案，浓缩步骤(b)通过蒸发溶剂进行(当需要时)，优选在减压下浓缩。按照另一个实施方案，浓缩步骤(b)通过冻干进行(当需要时)。按照另一个实施方案，浓缩步骤(b)通过透析进行(当需要时)。按照另一个实施方案，该多糖制品步骤(c)中的沉淀通过加入乙醇至最终浓度约80％乙醇来进行。按照另一个实施方案，该多糖制品步骤(c)中的沉淀通过冷却此提取物进行。按照另一个实施方案，该多糖制品步骤(c)中的沉淀通过加入某种盐进行。按照另一个实施方案，此盐是硫酸铵。按照另一个实施方案，在步骤(d)中沉淀的多糖制品的分离通过过滤进行。按照另一个实施方案，在步骤(d)中沉淀的多糖制品的分离通过离心进行。按照另一个实施方案，在步骤(e)中沉淀的多糖制品的洗涤用95％乙醇进行。按照另一个实施方案，该方法进一步包括通过将此沉淀溶解于水中并通过超滤基本上除去分子量小于约100,000道尔顿的所有组分，进行纯化。按照另一个实施方案，该方法进一步包括通过将此沉淀溶解于水中并通过大小排阻层析基本上除去分子量小于约2百万道尔顿的所有组分，进行纯化。
按照另一个实施方案，为刺激个体的单核细胞/巨噬细胞的活性用免疫刺激多糖制品治疗个体的方法，该方法包括给该个体使用有效量的提取自食品级微藻的多糖制品以及可接受的载体。按照另一个实施方案，使用该免疫刺激多糖制品以促进伤口愈合。按照另一个实施方案，使用该免疫刺激多糖制品以治疗癌症。按照另一个实施方案，使用该免疫刺激多糖制品以治疗免疫缺陷。按照另一个实施方案，使用该免疫刺激多糖制品以治疗病毒、细菌或真菌感染。按照另一个实施方案，所述个体是人。按照另一个实施方案，所述个体是动物。按照另一个实施方案，为刺激个体的单核细胞/巨噬细胞的活性用免疫刺激多糖制品治疗个体的方法，该方法包括给该个体使用有效量的提取自水华束丝藻的多糖制品以及可接受的载体。按照另一个实施方案，为刺激个体的单核细胞/巨噬细胞的活性用免疫刺激多糖制品治疗个体的方法，该方法包括给该个体使用有效量的提取自蛋白核小球藻的多糖制品。按照另一个实施方案，为刺激个体的单核细胞/巨噬细胞的活性用免疫刺激多糖制品治疗个体的方法，该方法包括给该个体使用有效量的提取自钝顶螺旋藻的多糖制品。

图1.多糖制品NP16847(实施例1)的大小排阻HPLC层析图，注射量为75μL，浓度为500μg/mL。
图2.多糖制品NP16848(实施例2)的大小排阻HPLC层析图，注射量为200μL，浓度为125μg/mL。
图3.多糖制品NP16846(实施例3)的大小排阻HPLC层析图，注射量为200μL，浓度为35μg/mL。
图4.微藻多糖制品NP16847、NP16848和NP16846促进促炎性细胞因子mRNA的产生。在THP-1细胞中在2小时时，得到IL-1mRNA、TNF-αmRNA和GAPDH mRNA的RT-PCR的结果对照，细菌LPS，10μg/mL，(1)多糖制品NP16847，0.5μg/mL，(2)多糖制品NP16846，0.5μg/mL，及(3)多糖制品NP16848，0.5μg/mL。
图5.流程图，其显示在40℃热水提取，接着用70％乙醇沉淀除去藻蓝蛋白物质的方案(实施例4)。
图6.流程图，其显示在40℃热水提取，接着用硫酸铵沉淀除去藻蓝蛋白物质的方案(实施例5)。
图7.流程图，其显示在70℃用热水提取的方案(实施例6)。
图8.流程图，其显示在40℃用70％乙醇提取，不用丁醇萃取的方案(实施例7)。
图9.流程图，其显示在40℃用70％乙醇提取，接着直接用乙醇沉淀的方案(实施例8)。
图10.流程图，其显示在40℃用70％乙醇提取，接着直接用80％乙醇沉淀的方案(实施例9)。
图11.用50％乙醇/60℃的最佳提取条件获得的NP16847制品，在超滤前后的SEC HPLC分析(实施例24)。
具体实施例方式
用检测THP-1人单核细胞/巨噬细胞中NF-κB活化的基于转录因子的生物试验，指导免疫刺激多糖的纯化以及它们提取的最佳方法。此试验检测的免疫刺激活性，以NF-κB导致的荧光素酶报告分子表达的增加来表示。在37℃，5％二氧化碳和95％空气下，将THP-1人单核细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)培养于RPMI 1640培养基中，其中添加了小牛血清(10％ v/v)和丁胺卡那霉素(60mg/L)。将活跃生长的细胞用DEAE-葡聚糖(10μg/l×106细胞)和pBIIXLUC报告分子质粒(1μg/l×106细胞)进行短暂的转染。此质粒得自Dr.Riccardo Dalla-Favera，其中含有得自HIV/IgK的两个拷贝的NF-κB基元(37)。将含有THP-1细胞的转染溶液在37℃水浴中孵育7分钟。然后，将转染后的细胞再悬浮于10％ FBS、RPMI 1640培养基中并以每孔2×105的密度置于96孔板中。24小时后，将微藻提取物、馏分和多糖制品加入到转染细胞中。收集细胞，并在加入样品后4小时检测荧光素酶活性。用Packard过滤板收集细胞并用30μL的荧光素酶混合物(1∶1，LucLiteTM荧光素酶1×PBS，1mM Ca和Mg)。LucLiteTM荧光素酶报告分子基因检测试剂盒购自Packard(Downers Grove，IL)。用Packard微量板闪烁计数器以单光子方式检测光发射。以相对于用作阳性对照的10μg/mL LPS(E.coli，血清型026B6，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)产生的对NF-κB的最大激活的百分率报告激活作用。
由The University of Georgia，Complex Carbohydrate Research Center进行糖基组分和糖基键分析。用TMS-甲基糖苷的GC-质谱分析测定糖基组成。为了确定在TMS-甲基糖苷方法中检测的O-甲基化的糖，还用糖醇乙酸酯方法测定糖基组分(38)。用Hakomori方法进行糖基键分析(39)，同时进行羧基-还原以检测糖醛酸连接(40)。
实施例1-表现出强单核细胞激活性质的得自AFA的高分子量多糖制品(NP16847)的粗分离得自AFA的粗提物(Lot No.0110FA，得自Cell Tech，Klamath Falls，OR)，通过用70％乙醇在40℃提取冻干物(125g)三次(各4小时)来制备。此粗提物EC50值为10μg/mL。将含水乙醇提取物蒸发至干，然后在水和氯仿(1∶1)之间进行溶剂分配。只在水层中发现活性，将其进一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。将活性更强的水层(EC50＝0.5μg/mL)在-80℃进行24小时的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。将此沉淀物质称为超滤前制品，其EC50值为0.2μg/mL，且就AFA干重而言回收率为3％。再将此物质通过超滤装置，该装置具有截留分子量为100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。将渗余物依次用3％KCl(w/v)洗涤几次以除去粘附(也许是通过离子相互作用)至大分子量物质上的不纯物。此渗余物，称为超滤后物质，EC50值为0.1μg/mL，回收率为0.6％。
用比色检测法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，评估超滤后NP16847制品的糖类含量为90％至100％。以此推断此物质是多糖制品。由Galbraith Laboratories，Inc.(Knoxville，TN)进行元素分析，表明该物质含有下列元素49.1％C，40.8％O，7.62％H，2.46％N以及痕量的S。超滤后物质的糖基组分和连接分析见表1。NP16847主要由甘露糖，葡萄糖，4-甲基甘露糖，鼠李糖和甲基化的糖残基以及其它单糖和乙酰基化氨基糖组成。这第一次报告了从AFA中分离的表现出任何类型的生物活性的多糖。
超滤后物质NP 16847用大小排阻层析(SEC)进行分析。该套装置由Model 600E系统控制器、UK6注射器、Model 600溶剂传输系统、Model 401示差折射计和Model 3396A Hewlett-Packard积分仪组成。以流速1mL/分钟，用HPLC级水和Shodex Ohpak KB-805SEC柱(300mm长×8mm ID)，保持30℃，进行分析。此柱能够分离估计分子量至4百万道尔顿的分子。对超滤后的NP16847进行分析显示了在外水体积中洗脱的一个峰(图1)，与葡聚糖标准物比较，其滞留时间与表观分子量超过2百万道尔顿一致。
实施例1描述的分离纯化AFA多糖的方法是新的，因为其初步提取用70％乙醇，而现有技术的方法用热水。为了确定该方法是否可以用作从其它食品级微藻中提取免疫刺激多糖的一般方法，将实施例1描述的方法用于其它两种微藻，它们常作为食品增补剂，即蛋白核小球藻和钝顶螺旋藻。
实施例2-表现出强单核细胞激活性质的得自蛋白核小球藻的高分子量多糖制品(NP16848)的粗分离得自蛋白核小球藻的粗提物(Lot No.VP0978得自Sun Chlorella，Torrance，CA)，通过用70％乙醇在40℃提取冻干物(35g)三次(各4小时)来制备。此粗提物EC50值为25μg/mL。将含水乙醇提取物蒸发至干，然后在水和氯仿(1∶1)之间进行溶剂分配。只在水层中发现活性，将其进一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。将活性更强的水层在-80℃进行24小时的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。再将此物质通过超滤装置，该装置具有截留分子量为100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。将渗余物依次用3％KCl(w/v)洗涤几次以除去粘附(也许是通过离子相互作用)至大分子量物质上的不纯物。超滤后物质EC50值为0.3μg/mL，回收率为0.2％。
用比色检测法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，评估超滤后NP16848制品的糖类含量为90％至100％。以此推断此物质是多糖制品。超滤后物质的糖基组分和连接分析见表2。NP16848主要由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和甲基化的糖残基以及其它单糖和乙酰基化氨基糖组成。虽然文献中已报告了得自小球藻属多个种类的其它免疫刺激多糖和水溶性制品，但是NP16848是新的组合物。
超滤后物质NP16848用实施例1中描述的HPLC大小排阻层析方法进行分析，发现了在外水体积中洗脱的一个峰(图2)，与葡聚糖标准物比较，其滞留时间与表观分子量超过2百万道尔顿一致。
实施例3-表现出强单核细胞激活性质的得自钝顶螺旋藻的高分子量多糖制品(NP16846)的粗分离得自螺旋藻属的粗提物(Lot No.B 16933得自Triarco Industries，Wayne，NJ)，通过用70％乙醇在40℃提取冻干物(35g)三次(各4小时)来制备。此粗提物EC50值为50μg/mL。将含水乙醇提取物蒸发至干，然后在水和氯仿(1∶1)之间进行溶剂分配。只在水层中发现活性，将其进一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。将活性更强的水层在-80℃进行24小时的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。再将此物质通过超滤装置，该装置具有截留分子量为100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。将渗余物依次用3％KCl(w/v)洗涤几次以除去粘附(也许是通过离子相互作用)至大分子量物质上的不纯物。超滤后物质EC50值为0.3μg/mL，回收率为0.1％。
用比色检测法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，评估超滤后螺旋藻属制品的糖类含量为90％至100％。以此推断此物质是多糖制品。超滤后物质的糖基组分和连接分析见表3。NP16846主要由鼠李糖，葡萄糖醛酸，岩藻糖，半乳糖和甲基化的糖残基以及其它单糖、糖醛酸及乙酰基化氨基糖组成。文献中已报告了得自螺旋藻属多个种类的具有类似糖基组分的其它多糖，但是粒径远比NP16846小。
超滤后物质NP16846用实施例1中描述的HPLC大小排阻层析方法进行分析，发现了在外水体积中洗脱的一个峰(图3)，与葡聚糖标准物比较，其滞留时间与表观分子量超过2百万道尔顿一致。
单核细胞/巨噬细胞的活化检测促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的信使RNA水平，以确定微藻多糖制品对THF-1单核细胞/巨噬细胞的激活。作为对照，还检测GAPDH的mRNA水平，以确定IL-1β和TNF-αmRNA水平的特异性变化。由于GAPDH是管家基因，mRNA水平预计应保持恒定，除非人为地引起变化。
IL-1β、TNF-α和GAPDH的RT-PCR引物购自Integrated DNAtechnologies，Inc.(Coralville，IA)。引物的序列描述于Su等的文献(42)中。L-1β正向引物(5′-ATG-GCA-GAA-GTA-CCT-AAG-CTC-GC-3′)；IL-1β反向引物(5′-ACA-CAA-ATT-GCA-TGG-TGA-AGT-CAG-TT-3′)；TNF-α正向引物(5′-GAG-TGA-CAA-GCC-TGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC3′)；TNF-α反向引物(5′-GCA-ATG-ATC-CCA-AAG-TAG-ACC-TGC-CCA-GAC-T-3′)；GAPDH正向引物(5′-TGA-AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GT-3′)；GAPDH反向引物(5′-CAT-GTG-GGC-CAT-GAG-GTC-CAC-CAC-3′)。
将活跃生长的THP-1细胞(3mL，1×106细胞/mL)在被测物质的存在下孵育2小时。用TRI Reagent试剂盒(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)分离全部RNA，其中细胞用酚和硫氰酸胍联合裂解。加入溴氯丙烷后，将RNA分离到水相，然后用异丙醇沉淀。用此方法回收的总RNA约为30μg。用0.8％琼脂糖凝胶进行的分离后RNA的电泳，没有显示出污染DNA的信号。
用Promega(Madison，WI)的试剂盒试剂进行RT-PCR反应。各反应用下列组分(总体积30μL)6μL AMV/Tfl 5x反应缓冲液，0.6μL dNTP混合物(10mM)，1.2μL MgSO4(25mM)，0.6μL AMV逆转录酶(5单位/μL)，0.6μL TflDNA聚合酶(5单位/μL)，1.2μL的各引物(15pmol/μL)，及2ng总RNA(IL-1β，TNF-α)或5ng总RNA(GAPDH)。用Techne Unit Progene自动热循环仪进行RT-PCR。第一个循环在48℃45分钟，接着在94℃2分钟。用35个循环完成扩增在94℃变性45秒，在60℃退火1分钟，并在68℃延伸2分钟。最后的循环将样品在68℃保持7分钟。用12μL的反应混合物在5％聚丙稀酰胺凝胶上用溴乙啶作为染色剂完成RT-PCR产物(mRNA IL-1β，TNF-α和GAPDH)的电泳。
与对照组相比，用LPS或微藻多糖制品处理THP-1细胞都导致IL-1βmRNA(810bp)和TNF-αmRNA(444bp)的显著增加。管家基因甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH，1000bp)的mRNA水平对于所有样品来说都是相同的(图4)。
所观察到的NP16847、NP16848和NP16846对NF-κB的激活不是由于这些制品中的内毒素杂质。这通过确定此可能性的下列两个试验的结果得到了证实。首先，联合加入多粘菌素B(10μg/mL，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和各多糖制品(0.1至1μg/mL)，观察在NF-κB激活中是否存在任何消弱。多粘菌素B是已知通过结合LPS分子的脂A部分来阻断LPS的多种生物作用的多阳离子抗生素。所有三个微藻多糖制品对多粘菌素B的加入不敏感(数据未给出)。向LPS中加入多粘菌素B(10μg/mL)将NF-κB激活降低了75％。用来检测可能的内毒素介导的作用的第二个试验，在糖基组分分析中寻找β-羟基豆蔻酸酯的存在。在NP16848和NP16846的样品制品中没有检测到β-羟基豆蔻酸酯。因此，观察到的NP16848和NP16846引起的巨噬细胞激活不太可能是由内毒素引起。
但是，在NP16847的两个不同样品中检测到了少量的β-羟基豆蔻酸酯(总峰面积的0.6％)。为了确定存在多少“内毒素样”物质，用Limulus阿米巴状细胞裂解物(LAL)试验(由Bio Whittaker，Walkersville，MD进行分析)分析AFA的六个样品。用此试验检测到的LAL阳性物质的量为微藻干重的0.002％。通过比较，NP16847的回收百分率高出约300倍(微藻干重的0.6％)。这意味着NP16847处在产生半数最大NF-κB激活的浓度时(100ng/mL)，潜在LAL阳性物质的总量应为300pg/mL。内毒素的此浓度用巨噬细胞试验系统是不能检测到的。因此，可能的内毒素污染不能解释NP16847对巨噬细胞激活的刺激作用。
实施例1至3说明了用70％乙醇在40℃可以从食品级微藻中提取具有强免疫刺激活性的多糖制品。这些多糖制品分离中的随后步骤包括复杂的方案及有机溶剂的使用。按照惯例，由于其具有高的水溶性，用热水从天然原料中提取多糖。因此，与首先用70％提取相比，此热水分离方法预计会得到更高收率的这些多糖。此外，由于热水提取物一般很少含有非极性物质，故将不需要用有机溶剂萃取(如果此方法可行)。但是，恰恰相反，水提取(实施例4至6)得到的制品，实际上，与首先用含水乙醇提取(实施例1)的方法得到的制品相比，活性要小，并还带来了其它问题。
如上述实施例所述，进行HPLC大小排阻层析分析并检测免疫刺激活性(巨噬细胞的活化)。在各实施例中所用微藻是冻干的AFA(Lot.041900Merc)，得自Klamath Algae Products Inc.，Klamath Falls，OR。超滤(当使用时)用具有截留分子量为100,000的聚醚砜膜的(Centricon Plus-20 foom Millipore，Bedford，MA)装置进行。对于该试验，超滤后的渗余物用3％KCl(w/v)洗涤若干次，以除去粘附(也许是通过离子相互作用)至大分子量物质上的不纯物。
实施例4-40℃水提取并用乙醇沉淀法除去藻蓝蛋白40℃AFA的水提取存在问题，因为此粗提物含有大量的藻蓝蛋白(蓝色蛋白质色素)。通过超滤无法成功除去藻蓝蛋白，由于此物质与NP16847多糖制品一起保留在截留分子量为100,000道尔顿的过滤器中。用乙醇彻底沉淀藻蓝蛋白物质需要70％乙醇或浓度更高的乙醇(未给出数据)溶液。为了评价此方法，在40℃将10g的冻干AFA用水提取三次(62.5mL每次)，每次4至8小时。将粗水提物冻干并再溶解于40mL的水中。室温下加入乙醇(92mL)至乙醇最终浓度为70％。除去沉淀的物质(含有藻蓝蛋白)，并将上清液通过超滤装置。评价此分离步骤中每步物质对巨噬细胞的活化作用(图5)。十分清楚，在70％乙醇沉淀过程中，大部分免疫刺激活性损失在该沉淀物(也含有藻蓝蛋白)中。用此方法得到的超滤后物质(高于100,000道尔顿)的回收率为1.0％。虽然，此回收率高于实施例1中用70％乙醇提取方法得到的超滤后物质的回收率0.6％，但该物质含有NP16847以外的其它物质，因为它的EC50值为1000ng/mL，而实施例1的物质的EC50值为100ng/mL。
实施例5-40℃水提取并用硫酸铵除去藻蓝蛋白分离藻蓝蛋白的方法(43，44)一般使用硫酸铵沉淀(40-65％饱和度)。现研究此方法，以便评价硫酸铵沉淀是否能够从此粗提物中选择性除去藻蓝蛋白。在40℃将冻干AFA(10g)用水提取三次(62.5mL每次)，每次4至8小时。将粗水提物冻干并再溶解于40mL的含48g硫酸铵(50％饱和度)的水中。除去沉淀物质(含藻蓝蛋白)并将此上清液通过超滤装置。超滤后物质的百分回收率是1.32％，但是其中可能含有极少的NP16847，因为其特异活性非常低(EC50＞1000ng/mL)。附图6总结了该分离方法中每步物质的免疫刺激活性。与前面的研究类似，硫酸铵的加入使大部分NP16847与藻蓝蛋白一起沉淀。
十分清楚，无法成功地分离粗水提取物中的藻蓝蛋白和NP16847。此外，将残渣物质(40℃水提取后残余物)用含水乙醇在较高温度下(例如，50％乙醇/60℃)进行重提取，分离出大量的NP16847(见实施例43)。因此，在40℃用水提取没有使NP16847完全回收。
实施例6-70℃热水提取在较高温度如70℃进行的水提取，会导致藻蓝蛋白变性并沉淀，剩下NP16847及其它极性分子在溶液中。为了评价此方法，将20g的冻干AFA在70℃用水提取三次(125mL每次)，每次4至8小时。此粗提物似乎不含任何藻蓝蛋白物质，因为看不出蓝色。将粗水提物冻干并再溶解于80mL的水中。在-20℃，将NP16847用醇(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)沉淀24小时。沉淀物质通过超滤装置。附图7总结了该分离方法中各步物质的免疫刺激活性。超滤后物质的巨噬细胞激活的EC50值(200ng/mL)比实施例1得到的物质(100ng/mL)略高。用此方法得到的超滤后物质的回收率为1.74％，比实施例1的70％乙醇方法得到的0.6％NP16847回收率有本质的提高。因此，如通过对超滤后物质的EC50值进行比较所示，用70℃水提取回收了约3倍的NP16847。
用热水提取(在70℃)的NP16847的分离，比实施例1中的分离方法产生了若干优点。没有使用有机溶剂，得到终产物只需要几个步骤，并提取了约3倍的NP16847。但是，该方法存在若干缺点。首先，粗水提物为了浓缩需要冻干，以避免沉淀中醇的体积过大。其次，超滤前物质含有大量的无活性物质(如通过约500ng/mL的低EC50值和附图7中HPLC色谱图所证实)，用超滤装置其纯化非常慢。
基于对实施例1描述的70％乙醇提取方法的改进，以下评价了若干其它方法。如下实施例描述的分离方法不需要使用有机溶剂，且在有限的几步中完成分离。这样，开发出克服了与用热水提取有关的所有问题的简单、经济且有效的方法。
实施例7-40℃70％乙醇提取，用氯仿萃取在实施例1为了提取NP16847，在正丁醇和水之间的第二溶剂分配步骤，导致免疫刺激活性大量损失到丁醇层中。因此，对实施例1的方案进行改良，除去正丁醇溶剂萃取步骤。此新方法与实施例1的方法相同，只是仅有在氯仿和水(1∶1)之间的一个溶剂分配步骤。附图8总结了此分离方案和此分离方法中各步的免疫刺激活性。用此方法得到的超滤后物质的EC50值(200ng/mL)略高于实施例1所得物质(100ng/mL)。用此方法得到的超滤后NP16847的百分回收率为1.97％。因此，从70％乙醇提取方法(实施例1)中除去正丁醇溶剂萃取步骤将超滤后NP16847的回收率提高了3倍以上。但是，此方法的主要缺点是在有机溶剂萃取步骤中使用了氯仿。
实施例8-40℃70％乙醇提取并直接进行醇沉淀为了评价不使用丁醇和氯仿萃取的方法，在40℃将10g的冻干AFA用70％乙醇提取两次(125mL每次)。第一次提取进行3小时，第二次提取进行12小时。将粗品70％乙醇提取物在-20℃保存几小时，并通过离心除去沉淀物质。将沉淀用冷的95％乙醇洗涤(除去残留的非极性物质)，再溶解于水，然后通过超滤装置。附图9总结了该分离方法中各步物质的免疫刺激活性。超滤后物质的EC50值(200ng/mL)略高于实施例1获得的物质(100ng/mL)。超滤后NP16847的百分回收率为1.2％。虽然此回收率比实施例1描述的提取方法所得的高出2倍，但是它比实施例7中方案所得回收率低约30％。较低的回收率可能是由于在70％乙醇中没有完全沉淀。
实施例9-40℃70％乙醇提取并直接进行80％醇沉淀将上述方法(实施例8)稍加改进以获得更大收率的NP16847。通过加入冷的100％乙醇，将得自70％乙醇提取的粗提物调节为80％乙醇并在-20℃保存几小时。沉淀物如上所述进行处理。附图10总结了此分离方案和此分离方法中各步的免疫刺激活性。此改良的方法得到超滤前NP16847制品的回收率为5.7％，且在单核细胞激活试验中EC50值为200ng/mL。超滤后物质的回收率为1.8％。超滤后物质EC50值(200ng/mL)略高于实施例1所得物质(100ng/mL)，但是与实施例6和7所得超滤后物质的EC50值相等。
此方法从粗品70％乙醇提取物中直接沉淀NP16847多糖制品(实施例9)，其目的顺利达到。不使用有机溶剂(或甲醇)，没有冻干/溶剂蒸发步骤，且获得NP16847的较纯制品只是需要几个步骤。除去超滤纯化步骤可得到NP16847的半纯制品(参见附图10中的超滤前或后物质的HPLC色谱图)。此超滤前NP16847制品足够用作食品增补剂(植物学的)提取物。此物质的分离只需要由粗品70％乙醇提取物直接进行乙醇沉淀。
下面总结了此分离方法(实施例9)优于其它被测方法的原因。
1.在40℃水提取。
a.含有高浓度的藻蓝蛋白，其不能通过超滤或者通过乙醇或硫酸铵沉淀从NP16847中分离。
b.超滤后所得NP16847特异活性低，EC50-1000ng/mL对应200ng/mL(实施例9)。
c.残渣物质含有大量的NP16847，在此温度下其不能用水提取回收(见
2.在70℃水提取。
a.在此温度下水提取，在超滤前物质中含有过量的无活性极性物质。这是不利的，原因有二个。首先，超滤前制品含低浓度的NP16847。其次，为了获得超滤后NP16847制品进行的超滤极其缓慢。
b.虽然此方法没有使用毒性有机溶剂，但是其确实需要粗提物的冻干步骤。
3.70％乙醇提取，接着有机溶剂萃取。
a.显而易见，此步骤的主要缺点是使用有机溶剂(即氯仿)来除去非极性物质。
上述实施例中，最佳的通用方法(实施例9)包括在40℃用70％乙醇对冻干AFA进行两次初步提取。将粗提物调节至80％醇并冷却至-20℃。收集沉淀并用冷的95％乙醇洗涤以除去残留的亲脂性物质。高分子量物质(超过100,000道尔顿)，含有约30％的超滤前多糖制品，可以用超滤方法分离。下面提供了实施例9所得NP16847制品与通过用70％乙醇/40℃提取制备的NP16847(实施例1)的比较结果NP16847(实施例9)NP16847(实施例1)超滤前物质回收率5.7％ 3.0％超滤前物质EC50值 200ng/mL200ng/mL超滤后物质回收率1.8％ 0.6％超滤后物质EC50值 200ng/mL100ng/mL这些数据表明用实施例9的方法提取AFA得到2倍的超滤前物质和3倍的超滤后物质NP16847。但是此方法所得超滤后物质的EC50值稍高于实施例1所得的，这表明回收率的提高部分是由于非活性物质。因此，实施例9中所用条件被选作进一步优化以改善NP16847制品的特异活性的起始点，因为该新分离方法提供了如下优点1.超滤前物质和超滤后物质NP16847多糖制品的最佳收率和良好的特异活性。
2.不使用毒性有机溶剂。
3.不包括大体积的水或溶剂的旋转蒸发或冻干。
实施例10-38提供了对改变的提取温度和乙醇浓度以优化实施例9中所用条件的详细分析。
实施例10-在50℃70％醇提取并直接进行80％醇沉淀将1g的冻干AFA在50℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到6.5％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例11-在60℃70％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在60℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到7.1％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例12-在70℃70％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在70℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到7.1％回收率的超滤前物质NP16847制品且其在单核细胞激活试验中的EC50值为75ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到2.7％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约35ng/mL。
实施例13-在80℃70％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在80℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到7.6％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为50ng/mL(表4)。
实施例14-在23℃70％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在23℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.5mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到4.5％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
实施例15-在23℃下60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在23℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到7.0％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
实施例16-在40℃60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在40℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到8.4％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为200ng/mL(表4)。
实施例17-在50℃60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在50℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.0mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到9.4％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例18-在60℃60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在60℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到9.5％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到3.5％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约75ng/mL。
实施例19-在70℃60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在70℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.0％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为50ng/mL(表4)。
实施例20-在80℃60％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在80℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.2％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为25ng/mL(表4)。
实施例21-在23℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在23℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到9.1％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为200ng/mL(表4)。
实施例22-在40℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在40℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到8.9％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例23-在50℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在50℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.1mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到9.4％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为75ng/mL(表4)。
实施例24-在60℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在60℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.8％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为25ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到4.5％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约20ng/mL。
实施例25-在70℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在70℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.2％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为25ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到5.6％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约20ng/mL。
实施例26-在80℃50％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在80℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.7％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为25ng/mL(表4)。
实施例27-在23℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在23℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.4％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
实施例28-在40℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在40℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.7％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例29-在50℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在50℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.0mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.3％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例30-在60℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在60℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.8％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为50ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到3.3％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约25ng/mL。
实施例31-在70℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在70℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.4mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.1％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为50ng/mL(表4)。
实施例32-在80℃40％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在80℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到12.6％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为50ng/mL(表4)。除去低分子量物质(＜100,000道尔顿)得到6.2％回收率的超滤后物质NP16847制品，而其EC50值为约30ng/mL。
实施例33-在23℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在23℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到13.7％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为200ng/mL(表4)。
实施例34-在40℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在40℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到13.8％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例35-在50℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在50℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。两次后合并两次提取物的上清液(11.1mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.9％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例36-在60℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在60℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.2mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到10.5％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为100ng/mL(表4)。
实施例37-在70℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在70℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.1mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.0％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中的EC50值为75ng/mL(表4)。
实施例38-在80℃30％乙醇提取并直接进行80％乙醇沉淀将1g的冻干AFA在80℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小时，再用6.25mL提取12小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.0mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到11.9％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中的EC50值为75ng/mL(表4)。
表4总结了用于首次提取的温度和乙醇浓度对上述最终结果的影响。用来评价各提取条件的有效性的最终结果，除了EC50值外还有超滤前物质的百分回收率。选择超滤前物质进行这些分析，是因为其作为食品增补剂或药物制品的潜在用途。除去超滤步骤将使该分离步骤产生实质上的简化。
用于实施例9的条件(70％乙醇/40℃)得到5.7％回收率的超滤前物质NP16847，其EC50值为200ng/mL。在初步提取中，在70％存在下将提取温度升高到40℃以上，增加了NP16847多糖制品的回收率和特异活性。但是，将提取温度从40℃降低至23℃，用70％乙醇或其它浓度的乙醇，并没有带来较低的EC50值。在此温度下(23℃)，在乙醇浓度较低时得到了较高的回收率。这种回收率的增加部分可能是由于对藻蓝蛋白更有效的提取，该物质蓝色的加深即是证明。在较高温度下用70％乙醇提取，稍微提高了回收率并在实质上增加了特异活性(例如，70％乙醇/80℃)。与其它浓度乙醇相比，用超过40℃的任何温度下用50％乙醇提取得到了较低的EC50值。在乙醇浓度超过或低于50％时，在各温度条件下特异活性一般降低。浓度超过或低于50％的乙醇对回收产生相反的作用较高乙醇浓度使回收率下降，但是较低浓度时稍增加(在温度为50℃或50℃以下)。在乙醇浓度高于50％时带来的回收率和特异活性的降低，表明在这些条件下提取的NP16847较少，对于低于50％的乙醇浓度，回收率的提高以及特异活性的降低，表明与NP16847一起提取出的非活性物质更多。在低于60℃用30％和40％乙醇提取，部分非活性物质最可能是由于对藻蓝蛋白更有效的提取，该沉淀蓝色的加深再次成为证据。
表4中60℃-80℃50％乙醇的区域代表了得到最佳回收率和特异活性的条件。优选的温度范围是60℃至70℃之间(实施例24和25)，因为对80℃40％至60％乙醇提取条件下得到的超滤前物质和超滤后物质的进一步分析，显示了大量的水溶性物质。这些最佳条件带来的超滤后物质的回收率为4.5％至5.6％(比实施例1的70％乙醇/40℃条件高出7.5至9.3倍)，而EC50值约为20ng/ml(比70％乙醇/40℃条件低5倍)。
实施例39-缩短提取时间表4中的数据是针对提取两次的物质收集的，在每个条件下第一次提取3小时，第二次提取12小时。为了便于大规模提取NP16847，检测各缩短1小时的结果，并发现就回收率和特异活性而言是相等的。
实施例40-在95℃只用热水提取30分钟现有技术从其它类型的微藻中分离免疫刺激多糖的方法(17，27)一般包括在95℃只用热水提取30分钟。为了评价此方法，将1g的冻干AFA在95℃用20mL的水一次提取30分钟。将水提取液调至80％乙醇并在-20℃孵育几小时。收集的沉淀物回收率为12.1％，但是含有非常少的NP16847，因为此物质的EC50约500ng/mL。超滤得到的回收率为5.1％，但特异活性无变化。显然，这些条件不适于由AFA中提取NP16847。
实施例41-在4℃水提取，接着用50％乙醇/60℃再提取通过初步水提取选择性除去污染的极性物质而基本上不损失NP16847，这是可能的。检测两步骤的提取方法来评价此研究。第一步包括在4℃对AFA进行初步水提取，接着第二步在最佳条件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。虽然此方法的NP16847的特异活性与最佳条件所得结果是类似的，但是超滤前物质和超滤后物质的回收率降低了约70％。
实施例42-在23℃水提取，接着用50％乙醇/60℃再提取对实施例41的方法稍加改进，将提取温度由4℃升高到23℃。因此，第一次提取包括在23℃对AFA的初步水提取，接着第二步在最佳条件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。结果类似于实施例41(即特异活性与最佳条件下的特异活性可比，但是超滤前物质和超滤后物质的回收率降低了约70％)。
实施例43-在40℃水提取，接着用50％乙醇/60℃再提取对实施例41的方法稍加改进，将提取温度由4℃升高到40℃。因此，第一次提取包括在40℃对AFA的初步水提取，接着第二步在最佳条件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。结果类似于实施例41(即特异活性与最佳条件下的特异活性可比，但是超滤前物质和超滤后物质的回收率降低了约70％)。
实施例44-用70％乙醇/40℃提取，接着用50％乙醇/60℃再提取通过初步乙醇提取选择性除去污染的非极性物质而基本上不损失NP16847，这是可能的。检测两步骤提取方法来评价此研究。第一步包括在40℃用70％乙醇对AFA进行初步提取，接着第二步在最佳条件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。虽然对于超滤后物质NP16847来说，此方法比实施例24和25得到了稍好的EC50值(10ng/mL)，但是回收率仅1.0％。此超滤前物质回收率为2.2％，EC50值为20ng/mL。
纯化的NP16847的一个性质是它似乎对聚丙烯移液管头具有粘附性。为了避免在系列稀释中转移该物质引起的增大的EC50值，在每个稀释度之间更换移液管头。
超滤前、后NP16847的色谱分析见附图5-11。用实施例1的方法分离的NP16847制品一般以宽单峰的形式洗脱(图1)。但是，用改良的方法(实施例4-9)，超滤后物质NP16847以宽区的形式洗脱，其中似乎包括三个峰(参见附图5-10)。但是，通过将这些超滤后物质NP16847制品在水和氯仿(1∶1)之间进行溶剂分配，可以将此三峰变为宽单峰。附图9和10显示了用氯仿进行此分配后纯化的NP16847多糖峰的峰形。各色谱图的右侧远处的宽峰在空白对照中也出现，因此可能是氯仿造成的。多重峰向单峰的转变有几种可能的解释。可能存在与NP16847缔合的痕量非极性或脂肪类物质，其引起NP16847多糖的分子间缔合。这些较大的复合物给出多重峰。用氯仿除去非极性物质将破坏这些缔合并产生单色谱峰。脂肪类物质或非极性物质与NP16847可能的缔合可以解释为何此多糖物质用高浓度的含水乙醇是可提取的。由于其分子量非常高，NP16847是单一的多糖还是相关多糖的混合物是难以评价的。但是，在用最佳提取条件(50％乙醇/60℃-70℃，见图11)得到的前和超滤后物质NP16847制品中没有发生多重峰现象。这可能是由于较低的乙醇浓度或较高的提取温度造成的，或者两种因素兼而有之。
用对TMS-甲基糖苷进行GC-质谱分析评价不同NP16847制品的糖类组成(表5)。对实施例1的NP16847物质(NP1)再次进行分析，发现其糖类组成特性与以前所确定的相同。由于不同批号的AFA(购自其它公司)用于实施例4-44，用实施例1的提取方法从该新物质中分离NP16847制品(NP2)。该NP16847制品与NP1具有类似的糖基组分，这表明了AFA的不同批号之间的一致性。但是，NP2制品比NP1活性低5倍(表5)，这是由于在正丁醇/水分配过程中部分活性多糖损失到了正丁醇相中。总之，用最佳提取条件(在60℃和70℃用50％乙醇)得到的超滤前物质和超滤后物质NP16847制品(NP3-NP6)中也发现了类似的糖类组分。但是，超滤前物质NP16847比超滤后物质制品在葡萄糖组分方面一致性更高，而在N-乙酰基化糖单位方面一致性低。基于这些不同NP16847制品(NP1-NP7)的糖类组分的一致性，得知在该物质中存在的主要糖基是甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖。为了识别在TMS-甲基糖苷方法中检测到的O-甲基化的糖，还用糖醇乙酸酯分析来测定糖基组分。在这些制品中含有的甲基化的糖残基包括2-甲基鼠李糖、3-甲基鼠李糖、4-甲基鼠李糖、2-甲基岩藻糖、3-甲基阿拉伯糖和3-甲基甘露糖。令人感兴趣的是，这些NP16847制品含有5.1-12.5％甲基化的糖类残基以及高百分比的脱氧己糖(例如，鼠李糖和岩藻糖)。这些特征可以解释用较高浓度的含水乙醇产生的NP 16847多糖物质的不寻常的可提取性。
由于被测样品(NP1-NP7)EC50值的差异高达50倍，人们会预测它们之间糖类组成的一些不同。由于事实并非如此，显然用此参数不能确定NP16847制品的纯度或活性。因此，NP16847制品应更适于通过生物活性、大小以及在含水乙醇中的可提取性来定性。可能独特的结构特征是NP16847具有激活单核细胞/巨噬细胞能力的原因，而不是特异性糖类的组成。还可能NP1-NP7糖类组分反映了多糖对于含水乙醇溶液的可提取性，而免疫刺激多糖应以此类中某结构类型的形式存在。用热水提取所得物质(NP8和NP9)与用含水乙醇提取分离的NP16847制品(NP1-NP7)相比糖类组成差异很大，这一现象支持了该解释。热水提取AFA所得超滤前物质和超滤后物质的主要糖残基是葡萄糖(表5)。NP8和NP9另一个显著不同的特性是与用含水乙醇提取分离的NP16847物质相比鼠李糖的百分组成低。
实施例45-在65℃用60％甲醇提取，并直接进行80％醇沉淀将1g的冻干AFA在65℃用60％甲醇提取，先用7.5mL提取1小时，再用6.25mL提取1小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.5mL)。通过加入冷的100％甲醇将上清液的甲醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到1.8％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中EC50值为75ng/mL。
实施例46-在65℃用40％异丙醇提取并直接进行80％醇沉淀将1g的冻干AFA在65℃用40％异丙醇提取，先用7.5mL提取1小时，再用6.25mL提取1小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.5mL)。通过加入冷的100％异丙醇将上清液的异丙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到12.0％回收率的超滤前物质NP16847制品，而其在单核细胞激活试验中EC50值为100ng/mL。
实施例47-用100％乙醇回流提取并通过冷却至-20℃沉淀将1g的冻干AFA用100％乙醇回流提取，先用8.0mL提取1小时，再用6.50mL提取1小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.0mL)。将合并后的上清液在-20℃保存几小时，并通过离心移出沉淀物质。随后用冷的95％乙醇洗涤此沉淀。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。此提取方法得到0.68％回收率的超滤前物质NP16847制品，且其在单核细胞激活试验中EC50值为约750ng/mL。
实施例48-用含水乙醇从其它食品级微藻(小球藻属和螺旋藻属)中提取免疫刺激多糖物质用由AFA获得NP16847的方法，用含水乙醇在最佳条件下初步提取，所得制品比用热水提取所得物质的活性高20倍(单核细胞激活的EC50值分别为25ng/mL和500ng/mL)。
同样的含水乙醇提取方法也可以应用到其它食品级微藻中以获得富含免疫刺激多糖的制品。例如，上述专利(16，17，27)报告了小球藻属多种类和螺旋藻属多种类含有免疫刺激多糖，其是用热水提取的。但是，用含水乙醇(代替热水)提取给免疫刺激多糖带来了选择性的富集，于是从这些有机体中得到的制剂含有优异的生物活性和较高的回收百分率的活性物质(见如下试验)。
下列食品级微藻用于试验中蛋白核小球藻(Sun Chlorella，Lot.No.WS 1422)和钝顶螺旋藻(Nature′s Way，Lot.No.912091)。所有的多糖制品为超滤前物质。为了制备热水提取物，将1g的冻干微藻在95℃用20mL水提取30分钟。将热水提取物调至80％乙醇并在-20℃孵育过夜。从小球藻属所收集沉淀的回收率为13.2％而EC50值为1,000ng/mL。从螺旋藻属所收集沉淀的回收率为16.5％而其在单核细胞/巨噬细胞激活中EC50值为10,000ng/mL。
通过系统地改变初步提取中所用的温度和溶剂浓度(乙醇在水中的百分浓度)制备含水乙醇提取物。用百分回收率和巨噬细胞激活的EC50值的最终结果来确定制备免疫刺激多糖物质的最佳条件。用下列方法制备小球藻属和螺旋藻属提取物。将1g的冻干微藻在适当温度下提取，先用7.5mL的含水乙醇溶剂提取2小时，再用6.25mL的含水乙醇溶剂提取2小时。离心后合并两次提取物的上清液(11.3mL)。通过加入冷的100％乙醇将此上清液的乙醇浓度调至80％。之后在-20℃孵育几小时，离心收集沉淀并随后用冷的95％乙醇洗涤。将分离出的物质真空干燥并溶解于水中，浓度为10mg/mL。
得自小球藻属和螺旋藻属的免疫刺激制品的最佳回收率和特异活性的提取条件，类似于由AFA提取NP16847的最佳条件(60℃-70℃50％乙醇)。对于小球藻属，制备免疫刺激多糖物质的最佳条件包括在70℃用50％乙醇的初步提取。该条件所得超滤前物质回收率为6.5％，EC50值为25ng/mL。对于螺旋藻属，制备免疫刺激多糖物质的最佳条件包括在50℃至70℃温度之间用40％-50％乙醇进行的初步提取。这些条件所得超滤前物质回收率为约9.0％，EC50值为500ng/mL。比较而言，虽然热水提取物回收了多出约2倍的物质，但是它们与用含水乙醇的最佳提取条件所得制品比较活性降低了20至40倍。
总之，我们开发了由AFA最好地回收NP16847的简单、有效的分离方法。对于超滤前物质NP16847制品来说，最佳的提取方法是由两个被合并的提取物中直接用乙醇进行沉淀(在-20℃用80％乙醇)，这两个提取物分别在60℃-70℃用50％乙醇提取1小时。此超滤前物质NP16847制品占AFA干重的11％。用包括超滤的一个附加步骤除去所有低于100,000道尔顿的物质，可以获得相对纯的NP16847多糖制品，回收率为4.5％至5.6％。超滤前物质和超滤后物质制品具有几乎相同的EC50值(超滤前物质为25ng/mL而超滤后物质为20ng/mL)。与实施例1(在40℃用70％乙醇提取)所得NP16847物质比较，此最佳的超滤后物质制品含有高出7.5至9.3倍的NP16847，其活性高出5倍。此方法适于制备食品增补剂(植物性的)提取物及大体积的药物制品。
由AFA微藻获得免疫刺激多糖组合物(NP16847)的方法，同样可以用来从富含免疫刺激多糖(例如激活单核细胞/巨噬细胞)的其它微藻(包括小球藻属多个种类和螺旋藻属多个种类)中获得制品。所有三种微藻多糖制品的独特的糖类组成允许使用选择性地富集免疫激活物质的方法。这些多糖用传统的热水提取方法提取效果很差。热水制品与用最佳方法获得的制品比较，活性低了20至40倍。
药物制剂本发明还包括低成本的大体积多糖制品。用来分离这些多糖制品的微藻可以生长在箱中，类似于普通的培养人食用微藻的商业方法。这意味着供应没有问题，但对从天然产物中分离的化合物进行药物开发通常是主要问题。本发明的多糖制品以高浓度(占微藻干重的6.5％至11％)存在，并可以用本发明的简单、快速且低成本的技术加以分离。
在免疫缺陷疾病、癌症、伤口愈合和感染性疾病的治疗中，本发明的多糖制品可以用作免疫治疗剂，故本发明包括了药物组合物，其中含有任选地与药用载体或赋形剂混合的本发明的多糖制品。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有以达到预定目的的有效量的活性组分的组合物。具体地说，治疗有效量指有效防止被治疗对象所患症状的发生或减轻该症状。有效量的确定是本领域技术人员的一般知识，特别是基于本文中的详细描述。
所用组合物的量将依赖于以下因素所治疗的病症、所治疗的对象、患者的体重、所患疾病的严重性、给药的方式和具体医生的判断。
本发明的药物组合物可以以已知的方式来制备，例如，通过常规混合、溶解、制粒、包糖衣、磨细、乳化、包囊、包封或冷冻方法。
因此，本发明的药物组合物可以以常规方法用含有赋形剂和辅剂的一种或多种生理可接受的载体进行配制，这些载体有利于这些组分化合物加工为可以药用的制剂。适当的制剂依赖于给药途经的选择。
对于注射，本发明的制剂可以配制成水溶液，优选在生理相容缓冲液中，如Hanks溶液、林格氏溶液或生理的盐缓冲液中配制。对于透粘膜给药，在该制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。这些渗透剂是本领域公知的。
对于口服给药，通过将活性组分与本领域熟知的药用载体混合，可以容易地配制组合物。这些载体能够将本发明的化合物配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮剂等由接受治疗的患者口服摄入。将活性组分与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，并加工颗粒的混合物(如果需要在加入适宜的辅剂后)来获得片剂和锭剂核，可以获得口服药物制剂。适宜的赋形剂特别是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨醇；纤维素制品如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
如果需要，可以加入分解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐如藻酸钠。
糖锭核用适当包衣进行包被。为此，可以使用浓糖溶液，其中可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、真漆溶液、以及适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入到片剂或锭剂包衣中，用来鉴别或确定活性化合物配料的不同组合。
可以口服的药物制剂包括明胶制成的推进式胶囊(push-fit capsules)、明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封胶囊。该推进式胶囊可能装有与如下物质混合的活性组分填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，以及任选地稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以溶解于或悬浮于适宜的液体中，如脂油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。口服给药的所有制剂应该具有适宜此给药的剂量。
对于颊部给药，这些组合物可以是常规方式配制的片剂或锭剂。
对于吸入给药，本发明使用的组合物以气雾剂喷雾的形式便利地给药，该汽雾由加压包装或喷雾器发出，其中使用适宜的喷射剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜的气体。对于加压气雾剂，可以通过阀确定剂量单位，来转运已经计量的量。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊或药筒(例如明胶的)，其中含有化合物和适宜的粉末基质如乳糖或淀粉的强力混合物。
经配制，这些组合物可以通过注射，例如，通过快速输注(bolusinjection)或连续输液，进行非肠道给药。注射剂可以以单位剂型的形式存在，例如，在安瓿或在多剂容器中，其中加有防腐剂。这些组合物的形式可以是存在于油性或含水载体中的悬浮剂、溶液剂或乳液，并可以含有配制试剂，如助悬剂、稳定和/和分散剂。
非肠道给药药物制剂包括水溶性活性化合物的水溶液。此外，可以将活性组合物的悬浮剂配制为适当的油性注射悬浮剂。适宜的亲脂性溶剂或载体，包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。含水注射悬浮剂可以含有增加该悬浮剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，此悬浮剂还可以含有适宜的稳定剂或者增加化合物溶解度以制备高浓度溶液的试剂。
或者，活性组分可以是粉末形式，在使用前用适宜的载体如灭菌无热原水进行配制。
这些组合物还可以配制为直肠用组合物，如栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油脂。
除了上述制剂，这些组合物还可以配制为缓释制剂。这些作用时间长的制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射进行给药。因此，例如，这些组合物可以用适当的聚合或疏水物质(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂进行配制，或者配制为难溶衍生物，例如，难溶盐。
这些药物组合物还可以含有适宜的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶及聚合物如聚乙二醇。
适宜的给药途经可以，例如，包括口服、直肠、透粘膜、透皮或肠内给药，非肠道给药包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以局部而不是系统方式使用该组合物，例如，通过将该化合物直接注射到患病区，常常是以缓释制剂或持续释放制剂的形式。
此外，可以在靶向药物转运系统中使用该药物，例如，在用患病细胞的特异性抗体包被的脂质体中。这些脂质体将靶向该细胞并被该细胞选择性地摄入。
如果需要，这些组合物可以存在于包装或分配装置中，其中可以装有含有活性组分的一个或多个单位剂型。例如，此包装可以包括金属或塑料薄片如泡罩包装。此包装或分配装置可以带有给药说明。还可以制备含有本发明组分、在相容的药物载体中的组合物，将其置于适当的容器中，并标明所治疗的适应症。标签上的适宜病症可以包括疾病的治疗。
食品增补剂适用于本发明的食品增补剂包括其中含有为达到其预定目的的有效量的活性组分的组合物。更具体地讲，有效量指能有效防止被治疗对象所患病症的发生或能减轻该病症的量。有效量的确定是本领域技术人员的一般知识，特别是基于本文中的详细描述。给药组合物的量将依赖于以下因素所治疗的病症、所治疗的对象、患者的体重、所患疾病的严重性、给药的方式和具体医生的判断。
本发明的食品增补剂的组分含于口服可接受的赋形剂和/或载体中。载体的确切形式及随之产生的该食品增补剂本身的形式并不重要。载体可以是液体、凝胶、凝胶片、胶囊、粉末、固体片剂(包衣的或非包衣的)、茶等等。适宜的赋形剂和/或载体包括麦芽糖糊精、碳酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、微晶纤维素、葡萄糖、米粉、硬脂酸镁、硬脂酸、交联羧甲基纤维素钠、淀粉甘醇酸钠、交联聚维酮、蔗糖、植物胶、琼脂、乳糖、甲基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素、玉米淀粉等(包括其混合物)。用常规技术将多种组分和赋形剂和/或载体混合，并配制为需要的形式。可以调整剂量水平/单位，以便每天以合理的单位数提供推荐水平的这些组分。
该食品增补剂还可以含有任选的组分，例如，包括草药、维生素、矿物质、增效剂、着色剂、甜味剂、调味剂、惰性组分等。这些任选的组分可以是天然的或者浓缩的形式。一种或多种此类组分的选择是配制、设计、消费者喜好及直接用户所涉及的问题。加入到本发明的食品增补剂中的这些组分的量是本领域技术人员容易确定的。U.S.RDA推荐的供给量可以提供儿童和成人用量的指导。
参考文献所有的参考文献，或者本申请中引用或涉及的文献，特引入本说明书中，以供参考。
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表1.用实施例1的提取方法由AFA微藻得到的分离后多糖制品NP16847的糖基组成和连接分析。由一个试验得出的数据

注甲基用“Me”表示。除非另行说明所有的糖基连接还有1位-连接。糖基缩写如下“T”表示末端连接，“f”表示岩藻糖，而“p”表示吡喃糖。在分析中两个糖基单元的存在表明存在共同洗脱的组分。
表2.用实施例2的提取方法由蛋白核小球藻微藻得到的分离后多糖制品NP16848的糖基组成和连接分析。由一个试验得出的数据

注甲基用“Me”表示。除非另行说明所有的糖基连接还有1位-连接。糖基缩写如下“Rha”表示鼠李糖，“Ara”表示阿拉伯糖，“T”表示末端连接，“f”表示岩藻糖，而“p”表示吡喃糖。在分析中二个或三个糖基单元的存在表明存在共同洗脱的组分。
表3.用实施例3的提取方法由钝顶螺旋藻微藻得到的分离后多糖制品NP16846的糖基组成和连接分析。由一个试验得出的数据

注甲基用“Me”表示而末端糖基连接以“T”表示。除非另行说明所有的糖基连接还有1位-连接。在分析中两个糖基单元的存在表明存在共同洗脱的组分。
表4在对AFA的初步提取中，温度和乙醇浓度对NP16847多糖制品的百分收率和特异活性的影响

图例XX.X 百分回收率XXng/mL EC50值表5从AFA分离的不同NP16847制品的糖基组成分析。数据得自一个试验。

#1＝实施例1NP16847(超滤后物质)，用70％乙醇在40C下提取#2＝新AFA原料NP16847(超滤后物质)，实施例1的条件#3＝超滤前物质NP16847，用50％乙醇在60C下提取(实施例24)#4＝超滤后物质NP16847，用50％乙醇在60C下提取(实施例24)#5＝超滤前物质NP16847，用50％乙醇在70C下提取(实施例25)#6＝超滤后物质NP16847，用0％乙醇在70C下提取(实施例25)#7＝用70％乙醇在40C下提取的残余物，NP16847(超滤后物质)用50％乙醇在60C下再提取(实施例44)#8＝超滤前物质，用100％乙醇在95C下提取(实施例40)#9＝超滤后物质，用100％乙醇在95C下提取(实施例40)
权利要求
1.免疫刺激制品，其自微藻分离，其中含有可用含水或者水和至少一种低级烷基醇的混合物的溶剂提取的多糖，所述烷基醇的烷基部分含有1至4个碳原子，所述活性多糖表观分子量高于约2百万道尔顿。
2.权利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述免疫刺激活性通过单核细胞/巨噬细胞的激活来显示。
3.权利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是水华束丝藻。
4.权利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是水华束丝藻。
5.权利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
6.权利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
7.权利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是钝顶螺旋藻。
8.权利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是钝顶螺旋藻。
9.权利要求3或4所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基组分基本上由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、甲基化糖和N-乙酰化氨基糖组成。
10.权利要求5或6所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基组分基本上由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甲基化的糖组成。
11.权利要求7或8所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基组分基本上由鼠李糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、半乳糖和甲基化的糖组成。
12.药物组合物，其中含有权利要求1-11任一项所述的免疫刺激制品以及药用载体或赋形剂。
13.食品增补剂，其中含有权利要求1-11任一项所述的免疫刺激制品以及食品增补剂可接受的载体或赋形剂。
14.为有治疗需要的个体提高免疫功能的方法，其中包括给所述个体有效量的权利要求12所述的药物组合物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述个体患有病毒、细菌或真菌感染。
16.权利要求14所述的方法，其中所述个体患有癌症或免疫缺陷。
17.权利要求14所述的方法，其中所述个体是人或动物。
18.为有需要的个体提高免疫功能的方法，其中包括给所述个体有效量的权利要求13所述的食品增补剂。
19.权利要求18所述的方法，其中所述个体患有病毒、细菌或真菌感染。
20.权利要求18所述的方法，其中所述个体患有癌症或免疫缺陷。
21.权利要求18所述的方法，其中所述个体是人或动物。
22.从富含免疫刺激多糖的食品级微藻中获得制品的方法，其中包括如下步骤(a)用含有水或水和至少一种低级烷基醇的混合物的溶剂提取所述微藻，制备提取物，其中所述烷基醇的烷基部分含1至4个碳原子，提取温度为约4℃至100℃；(b)任选地将所述提取物浓缩至较小体积，如果提取物体积较大就需要该浓缩步骤；(c)通过沉淀方法从所述提取物中沉淀出多糖制品；(d)通过分离方法分离沉淀的多糖制品；及(e)用95％的醇洗涤(d)的沉淀物。
23.权利要求22的方法，其中所述提取中所用的醇是乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇。
24.权利要求23所述的方法，其中在(a)中所述优选的醇浓度为20-80％。
25.权利要求23所述的方法，其中提取的优选温度是40至80℃。
26.权利要求23所述的方法，其中所述微藻是水华束丝藻。
27.权利要求23所述的方法，其中所述微藻是蛋白核小球藻或钝顶螺旋藻。
28.权利要求23所述的方法，其中浓缩步骤(b)通过蒸发溶剂进行(当需要时)，优选在减压下进行，或通过冻干进行(当需要时)。
29.权利要求23所述的方法，其中浓缩步骤(b)通过透析进行(当需要时)。
30.权利要求23所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入乙醇至最终浓度约80％乙醇沉淀所述多糖制品。
31.权利要求23所述的方法，其中在步骤(c)中通过冷却此提取物沉淀所述多糖制品。
32.权利要求23所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入盐沉淀所述多糖制品。
33.权利要求32的方法，其中所述盐是硫酸铵。
34.权利要求23所述的方法，其中在步骤(d)中通过过滤或离心分离沉淀的多糖制品。
35.权利要求23所述的方法，其中在步骤(e)中用95％乙醇洗涤沉淀的多糖制品。
36.权利要求23所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过超滤基本上除去分子量小于约100000道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
37.权利要求23所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过大小排阻层析基本上除去分子量小于约2百万道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
38.为刺激个体单核细胞/巨噬细胞的活性，用免疫刺激多糖制品治疗个体的方法，包括给该个体使用有效量的、提取自食品级微藻的多糖制品以及可接受的载体。
39.权利要求38所述的方法，其中使用该免疫刺激多糖制品以促进伤口愈合。
40.权利要求38所述的方法，其中使用该免疫刺激多糖制品以治疗癌症或免疫缺陷。
41.权利要求38所述的方法，其中使用该免疫刺激多糖制品以治疗病毒、细菌或真菌感染。
42.权利要求38所述的方法，其中所述个体是人或动物。
43.权利要求38所述的方法，其中所述微藻是水华束丝藻、蛋白核小球藻或钝顶螺旋藻。
44.权利要求24所述的方法，其中所述微藻是水华束丝藻、蛋白核小球藻或钝顶螺旋藻。
45.权利要求24所述的方法，其中所述提取的优选温度是40至80℃。
46.权利要求24所述的方法，其中浓缩步骤(b)通过蒸发溶剂进行(当需要时)，优选在减压下进行。
47.权利要求24所述的方法，其中浓缩步骤(b)通过冻干进行(当需要时)或通过透析进行(当需要时)。
48.权利要求24所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入乙醇至最终浓度约80％乙醇沉淀所述多糖制品。
49.权利要求24所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入盐沉淀所述多糖制品。
50.权利要求49的方法，其中所述盐是硫酸铵。
51.权利要求24所述的方法，其中在步骤(c)中通过冷却所述提取物来沉淀所述多糖制品。
52.权利要求24所述的方法，其中在步骤(d)中通过过滤或离心分离沉淀的多糖制品。
53.权利要求24所述的方法，其中在步骤(e)中用95％的乙醇洗涤沉淀的多糖制品。
54.权利要求24所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过超滤基本上除去分子量小于约100000道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
55.权利要求24所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过大小排阻层析基本上除去分子量小于约2百万道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
56.权利要求25的方法，其中所述微藻是水华束丝藻、蛋白核小球藻或钝顶螺旋藻。
57.权利要求25的方法，其中浓缩步骤(b)通过蒸发溶剂进行(当需要时)，优选在减压下进行，或通过冻干进行(当需要时)。
58.权利要求25的方法，其中浓缩步骤(b)通过透析进行(当需要时)。
59.权利要求25所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入乙醇至最终浓度约80％乙醇沉淀所述多糖制品。
60.权利要求25所述的方法，其中在步骤(c)中通过加入盐沉淀所述多糖制品。
61.权利要求60的方法，其中所述盐是硫酸铵。
62.权利要求25所述的方法，其中在步骤(c)中通过冷却所述提取物来沉淀所述多糖制品。
63.权利要求25所述的方法，其中在步骤(d)中通过过滤分离沉淀的多糖制品。
64.权利要求25所述的方法，其中在步骤(d)中通过离心分离沉淀的多糖制品。
65.权利要求25所述的方法，其中在步骤(e)中用95％乙醇洗涤沉淀的多糖制品。
66.权利要求25所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过超滤基本上除去分子量小于约100000道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
67.权利要求25所述的方法，其中还包括通过将所述沉淀溶解于水中并通过大小排阻层析基本上除去分子量小于约2百万道尔顿的所有组分来纯化所述沉淀物。
全文摘要
用含水乙醇提取方法可以将免疫－多糖优先从食品级微藻中提取出来。所得制品表现出极强的免疫激活活性。这些免疫刺激多糖的优先提取依赖于所用乙醇的浓度和提取温度。最有效的条件是50％乙醇浓度，60至70℃的温度。分离出的多糖制品将用作改善免疫功能的植物或药物制品。
文档编号A61P37/04GK1823848SQ20051011932
公开日2006年8月30日 申请日期2001年7月10日 优先权日2000年7月10日
发明者戴维·S·帕斯科, 尼梅尔·皮尤, 萨米尔·罗斯, 马芒德·埃尔索利, 哈拉·N·埃尔索利 申请人:密西西比大学