细胞基因敲除方法及步骤

我们知道在mRNA翻译成蛋白质的过程中，组成蛋白质的氨基酸是由三个相邻的碱基决定的，而mRNA的起始密码子一般是AUG。当翻译开始后，核糖体从AUG开始翻译，并且沿着mRNA进行移动，每相邻的三个碱基决定一个氨基酸。

当移码突变发生时，在基因组上增加或减少了非3的倍数个碱基。这时候，蛋白翻译依然从AUG起始密码子开始，但是由于增加或删除的碱基破坏了原来基因序列，导致了表达的蛋白序列完全改变了，甚至引起蛋白翻译提前结束。不管是哪种情况，原来的基因所表达的蛋白已经不存在了，因此我们就可以认为该基因已经被敲除了。

那么，假如出现增加或删减的碱基数是3的倍数这种情况呢？这种情况是不能算是移码突变的。除非增加或删减的碱基序列是在蛋白的关键功能域上，不然后续得到的蛋白依然有功能的，因此也就不能算是成功的基因敲除。理论上出现非移码突变的概率是1/3，但是在做基因敲除的过程中，我们可以通过测序手段筛选出突变的序列为非3的倍数，从而确保得到阳性克隆细胞是发生移码突变的。

片段敲除又是什么？

片段敲除就很好理解了，也就是通过基因敲除手段，让基因上的某个或某些外显子区域缺失。在利用CRISRP/Cas9进行片段敲除的过程中，我们会在要敲除的片段两端设计两条sgRNAs，然后通过Cas9蛋白对基因组进行切割，从而达到敲除片段DNA的目的。

这时有同学会问，只能敲除了某个外显子，而不能敲除整个基因么？在技术上其实是可以做到的，但是整个基因片段的敲除比较费时费力，而且有时还可能让你的结果非常不可信。首先，基因敲除的难度会随着敲除片段长度的增加而增加，一般基因包含的外显子区都比较短，但内含子区却很大，从而导致了一个基因至少都有10Kb以上的序列，这时要敲除整个基因就会变得很困难。而且，在基因的内含子区，往往并不是没有功能基因序列，他们有可能包含着其他基因的调控元件，如果全部敲除就会影响其他基因的表达，甚至影响了实验结果的可信度。

移码突变和片段敲除哪个更好？

细胞基因敲除策略，移码突变和片段敲除没有哪个是绝对的好与不好。对于大部分新手科研人员来说，大量阅读文献，参考别人的实验思路是一门必修课。然而，在选择移码突变和片段敲除时，在已发表的文章中很少明确指出到底采用哪种策略进行敲除。这说明，在那些实验大牛的眼里，移码突变和片段敲除只要能实现基因敲除就是好的方法策略。

例如，在这篇对甲基转移酶DNMT3的功能进行研究的文章中，作者就用了移码突变的方法，但是在实验方法那一栏就没有明确指出是使用移码突变还是片段敲除，只有从实验材料和数据中才能推断出它使用的是移码突变的敲除策略。

而下面这篇文章中，作者同时设计两条sgRNAs对基因进行小片段敲除，但也没有明确指出使用的是片段敲除策略。

由此可以看出，这些实验大牛根本不会去纠结移码突变和片段敲除哪个效果更好的问题。

至此，本文对移码突变和片段敲除的介绍就结束了。希望大家都能正确的认识这两者的区别，并得出自己的结论。