原代及传代细胞培养的实验方法

原代及传代细胞培养 细胞转染、原代培养、悬浮细胞、细胞株、transwell、流式细胞仪检测、树突状细胞、干细胞培养、磁珠分选

原代细胞培养是建立细胞系的关键，是各种培养经过的阶段。原代培养的特点是组织和细胞刚刚离体，生物性状还没发生很大的变化。原代培养细胞，所有机能上的改变主要是表型（phenotype）上的改变，不为体细胞突变。因此采用原代培养细胞做实验，如**测试，基因表达测试等有其独特的优点，是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。原代细胞培养主要有离散细胞原代培养和组织块原代培养两种方法。

组织块原代培养：

组织块培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织。组织块培养操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动收到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养可按下列程序操作：

1.组织块修整：将取材得到的组织块用平衡盐溶液反复冲洗，然后置于**的平皿或小瓶中用眼科剪剪碎，小块的直径一般小于1mm，剪碎的组织块京自然沉降富集备用。

2.贴壁与培养：用眼科镊夹取小组织块，将其摆放在培养皿或培养瓶的底面上，每个小块之间的距离为0.5-1cm。摆放时不可携带过多的培养液，摆放完毕后静止一段时间，使组织块与瓶壁贴牢后添加培养液。也可将摆放好的组织块的培养瓶底部向上置培养箱中培养2-3小时候再添加培养液。添加培养液时要缓慢，不可将组织块冲起。然后将贴有组织块的培养瓶或培养皿轻轻放入培养箱培养，较硬的组织块3d之内不必进行观察和换液，以免组织块浮起。培养一段时间后细胞可从小块边缘向四周游出。通过生长增殖，终亦可连接成片。原组织小块可散成细胞而消失。

离散细胞原代培养

动物细胞在体内有严密的组织结构，群体细胞之间以固有的分化方式相互联系，相互依存。离体之后仍保持原有的组织结构特性，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞，采取必要的措施进行人工分离（消化培养）。部分组织的细胞自然状态下士松散的，从体内取出后不经处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可制成细胞悬液。细胞离散后，由于每个细胞都能与赖于生长的支持物接触，营养供应均匀，因而具有适应快、增殖快、建系快等优点。

通常离散细胞的原代培养要经过取材、剪切、消化、接种等操作步骤。

1 取材

动物种类的不同、组织不同、生命期不同，其取材的方式也有所不同。胎儿组织是原代细胞培养的常用材料，具有不易污染、生命力强、易于消化、易于培养、易于适应等优点。小鼠胚胎、大鼠胎儿、鸡胚等小动物胚胎组织的取材，可将动物麻醉或处死后整体**（75%乙醇浸泡），然后送入无菌室，严格按无菌操作取材。

2 单细胞分离

机械分离

消化分离

体外培养细胞的纯化

原代细胞培养往往含有的细胞种类较多，多是实验需要纯化的细胞进行建系。而细胞纯化是细胞培养和细胞建系的关键技术之一。细胞纯化可分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。

悬浮细胞的纯化

密度梯度离心的方法是悬浮细胞纯化的常用方法，其基本原理是细胞密度不同，大小不同，离心式的沉降速率也就不同。在离心过程中沉降速率不同的细胞，可在不同的密度梯度界面上停留，使各类细胞相互分开。此外，还可根据细胞表面抗原种类的不同分离细胞。该技术要事先制备只对目的细胞的特异性抗体，让后将抗体纯化和固化，当要分离的细胞与固化抗体接触时便可将其捕捉，从而达到分离纯化的目的。目前许多市售的**细胞分离柱，如依据CD4和CD8表面抗原的细胞分离柱、B细胞分离柱、T细胞分离柱、巨噬细胞分离柱等。

依据贴壁速度的细胞纯化

原代细胞培养初期或细胞传代时均可依据细胞贴壁速度来分离不同类型的细胞。如原代培养的巨噬细胞群中往往含有**细胞，中性粒细胞，成纤维细胞等，根据大多数巨噬细胞有极易于附着在玻璃表面的特性，先将细胞群至于玻璃培养容器中数小时，此后再用培养液或PBS冲洗去除尚未附着的其他细胞，借此可得到较纯的巨噬细胞。

依据对消化酶敏感性的细胞纯化

细胞类型不同，对同一消化酶的敏感性不同，培养的贴壁细胞在消化时敏感的者从瓶壁上脱落下来，借此可将不同类型的细胞分离开来。