细胞迁移必备技能——划痕实验
细胞迁移的重要性
细胞迁移(cell migration)：也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。
它参与到很多生理和病理的活动中，如下：
免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一；
炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症部位并发挥其吞噬和组织损伤作用；
肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后随脉管系统实现远处转移；
损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参与消炎和凝血；
胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的正常发育。
细胞划痕实验
细胞划痕实验是目前测定细胞迁移运动与修复能力的最常用也是最简单的方法，基本原理是：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验（Wound-Healing Assay），广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。
原理：如下图所示：
细胞迁移动态图（来自网络）
实验过程
在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定的时间（可有不同时间点），取出细胞培养板，显微镜下观察周边细胞是否迁至中央划痕区，并拍照。
具体实验步骤
1. 培养板划线标记
用marker笔在6孔板背后画横线（用直尺比着），每孔至少穿过5条线，每条线均匀且平行。
6孔板背后划线图
2. 细胞铺板
在孔内接种约5-10*105个细胞（可根据细胞的生长快慢调整接种数量），原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀（细胞铺板均匀技巧可参考往期内容）。
3. 细胞划线
第二天用20uL枪头（灭菌）或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。
细胞划线姿势图（右图来自网络）
Tips：减少划痕距离的误差办法：
不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签；
枪头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺；
最好保持力度一致，尽量一次性划完。
4. 洗细胞，去除划下的细胞
划线完成后，使用无菌PBS洗细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清（<2%）的培养基。
Tips：
在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；
为了避免细胞数量和状态受到影响，尽量不要用吸泵，可用移液枪缓慢吸走。
5. 细胞培养与观察
将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点，如0，6，12，24小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。
6. 数据分析
举例：如细胞划痕常用于研究药物或者基因等对肿瘤细胞迁移能力的影响。通过比较Control组和CE(10ug/ml)组，发现CE显著抑制了小鼠黑色素瘤细胞系B16F10-Nex2的迁移能力。
B16F10-Nex2细胞迁移图[1]
数据处理：一般通过对初始划线（0h）和后期观察点的划痕的面积或距离对比来判断。
面积：如下为ImageJ计算划痕面积：
上图左：黄色包围的面积即为测量的划痕区；
上图中间：划痕区示意图
上图右：红色框内的数值即为测得的划痕区面积值
如下图为肝癌细胞系SK-hep1的迁移过程及划痕面积统计图[2]：
统计距离：使用 Image J 软件，划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。此外，还可以使用ImageJ软件测量划痕区域的像素来定量比较细胞迁移的速度。
如下图为B16F10细胞的迁移过程[3]，并统计迁移距离，计算出迁移速度：
常见问题解答
划痕实验为什么一般选择6孔板？
因为6孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察；当然若是需要高通量初筛时，也可以用12或者24孔板。
为啥细胞的接种密度原则为：过夜为100%融合？
若过夜后细胞未100%融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。
如何降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果？
① 使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响； ② 一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点（6，12，24h）检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；③ 如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理1h，抑制细胞的分裂。
如何确保拍照的观察点？
按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，划痕一次与5条定位线相交，就有10个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
细胞不迁移怎么办？
避开细胞状态的影响，需要考虑细胞自身的迁移能力，并非所有细胞都适合划痕实验，以乳腺癌为例，乳腺癌细胞MCF-7几乎很难迁移，而MDA-MB-231具有很强迁移性。
为什么有的文章用细胞计数分析？
因为有的细胞迁移轮廓比较清晰，并且迁移数量不多，我们可以选择细胞计数（如下图的HUVEC）；但如果细胞数比较多，连片生长，那么统计面积比细胞计数的方式更简便且客观（如上图的SK-hep1）。
细胞划痕法有哪些不足？
① 适用的细胞类型范围小，一是需要迁移强的细胞，而且对无血清的环境有较强的忍受力（至少24h）然而很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12h细胞凋亡就超过50%，因此细胞划痕法对部分肿瘤细胞并不适用。② 自身操作的实验误差，如划痕距离不一致等。
肿瘤转移是肿瘤研究的重要方向，因此转移相关研究方法十分重要。本期我们介绍了体外细胞转移的基本实验步骤及需要注意的细节，希望大家可以获益，拍出漂亮的细胞图片来。
参考文献
1.Figueiredo, C.R., et al. Antitumor activity of kielmeyera coriacea leaf constituents in experimental melanoma, tested in vitro and in vivo in syngeneic mice. Advanced pharmaceutical bulletin 4, 429-436 (2014).
2.Gao, W., Kim, H. & Ho, M. Human Monoclonal Antibody Targeting the Heparan Sulfate Chains of Glypican-3 Inhibits HGF-Mediated Migration and Motility of Hepatocellular Carcinoma Cells. PloS one 10, e0137664 (2015).
3.Justus, C.R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M. & Yang, L.V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of visualized experiments : JoVE (2014)
4.Jonkman, J.E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell adhesion & migration 8, 440-451 (2014).