免疫疗法相关肿瘤模型介绍
背景
在当今众多的癌症治疗手段中，免疫疗法无疑是近年来最为吸引人们眼球的“明星”治疗手段，普遍引起学术界及医学界的强烈关注和研究兴趣。
随着以T细胞受体T细胞技术（TCR-T）、嵌合抗原受体T细胞技术（CAR-T）以及免疫检查点阻断技术（Immune Checkpoint Blockade）为代表的新兴肿瘤免疫疗法不断取得临床上的突破和成功，奇迹频现，捷报频传，持续更新着人们对机体免疫系统潜在的强大肿瘤杀伤能力的认知，进一步提高人们战胜恶性肿瘤的信心，当然也持续激发着科研人员对“肿瘤免疫疗法”这一强大抗癌利器的研究和开发热情。
而对于肿瘤免疫疗法的研究，离不开相关动物模型的选择和建立。事实上，目前已经取得临床成功的肿瘤免疫疗法中，无一例外都已经过大量严格的临床前动物实验进行验证、评估和预测。可见，相关动物模型的建立对于肿瘤免疫疗法的开发和应用是至关重要且必不可少的。
免疫疗法相关肿瘤模型
一、以CAR-T/TCR-T为代表的细胞过继性疗法（Adoptive Transfer）常用肿瘤动物模型
细胞过继性疗法是指将供体（donor）细胞（此处主要是T淋巴细胞）经体外刺激活化或者基因修饰后再次回输入受者（Recipient）体内，从而达到相关治疗目的的治疗方式。
供体细胞可以是来源于受者自身，也可以来自于其他个体，前者称为自体移植（Autograft），后者则有两种情况，如果受者与供者属于相同种属，称为同种异体移植（Allograft），反之则为异种移植（Heterograft）。
CAR-T/TCR-T技术的主要技术路线是分离、扩增、纯化病人自身T淋巴细胞，经体外基因修饰使之表达具有肿瘤抗原/肿瘤相关抗原识别及结合能力的、人为改造的CAR或TCR分子，随后再将修饰后的T细胞回输入肿瘤患者体内，以唤醒和激发患者自身免疫系统，杀伤和清除体内肿瘤细胞。从这一层面来说，CAR-T/TCR-T疗法属于自体移植过程。
然而，相应的动物模型往往是将人源的修饰T细胞输入至接种有人源肿瘤细胞或肿瘤组织的成瘤小鼠体内，进而模拟人体内的治疗过程，此时，这一治疗方式则属于异体移植。
众所周知，异体移植的首要问题便是免疫排斥作用，为此，要将人源的肿瘤细胞、肿瘤组织以及修饰后的人源T细胞成功接种于小鼠，就必须使用高度免疫缺陷的实验小鼠。
目前用于CAR-T/TCR-T疗法动物模型的免疫缺陷小鼠比较单一，主要是非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷（Non-Obese Oiabetic ,Severe combined immunodeficiency, NOD/scid，基因型为NOD.CB17-Prkdcscid）小鼠以及NSG （NOD scid gamma，基因型为NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠。
NOD/scid和NSG小鼠都具有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）联合发育缺陷的特性，并且NSG小鼠表现为更强烈的T、B细胞功能缺陷，因而相较于NOD/scid小鼠，其应用范围较广。
用于建立模型的人源肿瘤细胞株则因研究目的及肿瘤类型不同而各不相同，但主要是高表达相应肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的细胞系或细胞株。
NOD/scid和NSG肿瘤模型具备优点：
①遗传背景明确；
②成瘤率高、肿瘤生长稳定；
③体内干扰因素少、适用肿瘤范围广以及模拟程度较高
缺点：但也存在着价格贵、成本高、培育时间长的不足，对于大规模使用局限性较大。
举例：下面，我们将以靶向CD19的CAR-T细胞治疗模型为例。
主要操作过程：
实验小鼠：NSG联合免疫缺陷小鼠
细胞株：外周血原代细胞制备的CD19特异性CAR-T细胞；人源B淋巴细胞瘤细胞系Nalm6细胞（高表达CD19），实验前一般需要将Nalm6细胞过表达荧光素酶报告基因（Luc-Nalm6），以便于后续的肿瘤细胞体内成像示踪。
注：常用于模型建立的高表达CD19的人源细胞系还有Daudi细胞和Raji细胞系，均属于B淋巴瘤细胞系；若是要建立NK细胞的体内肿瘤杀伤模型，一般选择K562细胞株建模。
操作步骤：
①制备原代CD19特异性CAR-T细胞；
②选取6-10周龄大小NSG小鼠，做好分组；
③制备Luc-Nalm6细胞PBS单细胞悬液，调整浓度为1×107cells/ml；
④每只NSG小鼠经尾静脉注射1×106 Luc-Nalm6细胞（100μl上述单细胞悬液）；
⑤肿瘤细胞注射7天后开始进行CAR-T细胞尾静脉注射，每次注射量约为5-10×106细胞。根据具体情况，可一次性注射，也可分批次2-3天注射一次；
⑥CAR-T细胞注射治疗一周后，将实验小鼠麻醉，进行IVIS体内成像观察、检测；根据肿瘤细胞存活情况进行后续的治疗处理。
图1. CAR-T/TCR-T疗法肿瘤模型构建模式图
图2. CAR-T疗法肿瘤模型IVIS体内成像效果，可见CAR-T细胞灌注后，肿瘤细胞荧光显著降低（参考文献1）
以上为血液瘤CAR-T治疗动物模型的建立及检测的主要操作过程，该法同样适用于CIK（Cytokine-Induced killer cell）、LAK（Lymphokine Activated killer cell）、肿瘤DC疫苗等其它过继性细胞疗法动物模型的建立。
对于其它肿瘤尤其是实体瘤，一般采取皮下、原位注射相应细胞系或直接移植肿瘤组织的建模方式；当然，考虑到建模成本、样本容量以及某些细胞株的易成瘤特性，也可采用胸腺发育缺陷的裸小鼠（T淋巴细胞缺陷）进行肿瘤建模，但一般均会对裸小鼠进行环磷酰胺注射的免疫抑制预处理，以提高建模和移植的成功率，具体操作方法需视研究目的及情况而定。
二、以PD-1/PD-L1、CTLA4为代表的免疫检查点阻断疗法常用肿瘤动物模型
与CAR-T/TCR-T等细胞过继疗法不同，免疫检查点阻断疗法的核心是释放免疫系统的“刹车”限制，即解除免疫系统的抑制及对肿瘤细胞的免疫耐受状态，重新激发免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力进而达到抗击肿瘤的效果。
因此，免疫检查点阻断疗法是依赖于机体自身的免疫细胞的，其动物模型的建立也往往采用具备正常免疫功能的小鼠（Immune competent mouse），将之进行同品系肿瘤细胞系移植，建立的是同系肿瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）。
同系肿瘤小鼠模型建立方法较为一致，重点是选择与实验小鼠品系相同的肿瘤细胞系。举例：笔者所在课题组进行的是基于C57BL/6小鼠背景的肿瘤相关功能基因研究，所采用的正是C57BL/6品系来源的黑色素瘤细胞系B16F10细胞以及路易斯肺癌细胞系LLC细胞。
主要操作过程为：
①皮下或原位注射相关细胞系；
②待肿瘤组织生长到一定程度，进行PD-1/PD-L1、CTLA4等免疫检查点治疗性单克隆抗体或相关化合物的体内给药处理；
③随后对肿瘤生长状况进行测量跟踪；
④大多数情况下，往往还要对给药后的成瘤小鼠进行外周淋巴器官及肿瘤组织内淋巴细胞的分离纯化；
⑤针对浸润免疫细胞的激活及杀伤功能进行系列检测，以最终评价相关药物对于免疫系统的激活情况及肿瘤治疗效果。
图3. 同系肿瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）的建立
同系肿瘤小鼠模型本质上属于同种异体移植，具有自身的优势和特点。
优点：
①具备完整的免疫功能，适用于靶向免疫系统的抗肿瘤研究；
②宿主排斥性小，能正常模拟肿瘤在体内的生长及发展过程；
③成本低，重复性好；
④适用肿瘤范围广；
⑤可操作性好，并且易于达到符合统计学要求的样本量。
缺点：同系肿瘤小鼠模型也会存在一些局限性，主要是肿瘤细胞为鼠源性，其表达的免疫检查点分子与人类的同源蛋白分子相比会有一定的差异，反映的药效对于人类肿瘤的治疗移植性也存在一定的偏差；另外，该模型中的肿瘤组织往往生长过快，不利于模拟自发肿瘤的生长情况。
尽管如此，同系肿瘤小鼠模型仍然是目前基于免疫检查点阻断的肿瘤免疫疗法研究领域备受青睐和广泛使用的研究模型，适用于大部分基于改善机体免疫状况及肿瘤微环境的肿瘤免疫疗法研究，未来必将得到进一步的优化和改进，在肿瘤免疫疗法相关药物筛选和评价中发挥重要作用。
图4. 同系肿瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）常用细胞系及其品系
总结
肿瘤免疫疗法是近年来崭现抗癌新希望的治疗手段，每一项新疗法的出现及临床应用都离不开大量的临床前动物实验数据的支撑。
鉴于肿瘤免疫疗法是一新兴的研究领域，其在大部分实体瘤的治疗方面局限性还比较大，尚有大量的研究工作需要开展和探究，相应的动物模型也因而必不可少。
目前，应用于肿瘤免疫疗法研究的动物模型主要还集中在基于重症联合免疫缺陷小鼠（过继性细胞回输）以及同系肿瘤细胞系小鼠模型（免疫检查点阻断）的研究，未来随着基因编辑技术在肿瘤免疫疗法领域的应用，以及多种治疗手段与免疫疗法组合的联合治疗方式的出现，对相关动物模型的建立和优化也提出了更高的要求，未来肿瘤免疫疗法相关动物模型也必将经历一系列的开发和优化过程。
参考文献
1、Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition Clin Cancer Res. 2016 Nov 4. pii: clincanres.1300.2016. [Epub ahead of print]
2、Pre-Clinical Murine Models: Syngeneic Models for Immuno-Oncology. 2015；http://medcraveonline.com/MOJI/MOJI-02-00052.pdf
3、The importance of animal models in tumor immunity and immunotherapy Curr Opin Genet Dev. 2014 Feb;24:46-51. doi: 10.1016/j.gde.2013.11.008. Epub 2013 Dec 29.
4、Animal models of tumor immunity, immunotherapy and cancer vaccines. Curr Opin Immunol. 2004 Apr;16(2):143-50.
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