基因敲除小鼠发展史
基因敲除原理
早期基因敲除主要利用DNA的同源重组原理，通过ES细胞打靶技术，设计同源片段代替靶片段。而近期热门的CRISPR/Cas9技术，通过人工优化的具有定位作用的单链引导RNA(single Guide RNA，sgRNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂（DSB），进而利用生物体内非同源末端修复机制（NHEJ）或同源重组机制（HR）修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物，并能稳定遗传。
图片图1. 基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除原理
下面就为大家介绍一下基于CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建。
基于CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建过程就如下图所示：
主要包括其中，gRNA设计和筛选，sgRNA表达载体构建，显微注射，胚胎移植，小鼠培育及繁殖及小鼠基因型鉴定等过程。详情请点击（基因编辑鼠的构建）
图片图2. 基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除鼠构建图
sgRNA设计及表达载体构建
其中，sgRNA的设计是通过在目标基因N端编码序列中寻找合适的靶序列完成的，可以利用软件（sgRNA Designer）预测潜在sgRNA序列。经过在http://crispr.mit.edu/网站上脱靶率预测后，在细胞中进行活性筛选后，取脱靶率较低的sgRNA构建打靶载体。随后将上述sgRNA与Cas9-mRNA一起注射入体外受精小鼠受精卵的胞浆部分，并将之移入假孕母鼠体内发育为子代小鼠。
小鼠基因型鉴定
胚胎移植后的小鼠约19天后出生，取子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定，即所谓的Founder，F0代。基因鉴定一般利用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR），即利用引物大量扩增目的片段。一般我们会选取目的片段上下游200-300bp长度的序列作为引物设计的对象。
①如果缺失的DNA片段有成百甚至上千个碱基，这样可以通过PCR产物长度来区分突变型和野生型小鼠基因型，较长即为未敲除片段，较短则为已敲除片段；
②如果缺失为几bp或者几十bp 无法通过PCR电泳图来区分野生型和突变型，那么需要进一步通过T7E1酶切或者测序的方法进行区分。如下图所示：
基因敲除纯合子（-/-）：只带有已敲除片段的小鼠为纯合子；
基因敲除杂合子（+/-）：同时带有已敲除和未敲除片段的小鼠为杂合；
野生型小鼠（+/+）：只带有未敲除片段；
注：也可以将PCR结果送测序以进一步确定。
图片图3. PCR结果示意图
小鼠交配与使用方案设计
通过对出生的小鼠进行鉴定，一般可以获得F0代基因突变鼠。待F0代小鼠性成熟后将其与具有相同突变类型的小鼠进行交配，可获得具有稳定突变的F1代纯合小鼠。如下：
基因敲除杂合鼠（+/-）与另一只杂合敲除鼠（+/-）交配，基于基因分离定律，其后代中纯合敲除（-/-），杂合敲除（+/-），野生型（+/+）的比例大致为1:2:1。通过基因鉴定，留下纯合敲除鼠即可稳定繁殖。
当然也可以大量获取基因敲除杂合鼠，实验前令其与另一批杂合鼠交配，通过基因鉴定留下子代纯合敲除鼠与子代野生型鼠作为实验材料。
图片图4. 杂合子小鼠交配基因分离示意图
小鼠分组
一般实验分组分为实验组（基因敲除鼠）与对照组（野生型），实验组就是基因敲除鼠（一般为纯合子）；而野生型则是具有相同遗传背景的鼠，可以是基因分离中留下的野生型鼠繁育得到，也可以是同品系野生型小鼠。
如药效检测实验，或是引入另一种改变小鼠性状的因素，则可以设计实验分组如下图所示：
小鼠只数
每组的小鼠只数尽量保证一致，一般每组5-8只比较合适。具体只数则可以参考同行的经验。
2016年发表在EMBO Molecular Medicine上： CRISPR/Cas9技术改善小鼠血友病的文章为例[1]。研究选取了10只或以上成年鼠取用于检测基因修复后的存活率；选取了5只或以上成年鼠用于验证信号通路、分子机制。
又例如Volker Haucke等人于2017年发表在PNAS上，研究ITSN1基因敲除对小鼠大脑的影响的文章中[2]，选取了7只或以上成年鼠进行实验，而较复杂的实验则选取4只。由此可见，如果条件允许，实验鼠选取8只左右是比较适宜的，研究修复作用或功能影响的可以多一些，以降低个体差异；而较难完成的实验则可以稍少一些，保证4只以上即可。
小鼠性别及年龄
实验一般选雄性小鼠，年龄控制在相近的时间段，一周之内最佳。一般实验会选用成年鼠，即3月龄的小鼠。如研究发育，则会按照发育过程相应的时间阶段选鼠，具体需要借鉴已发表的文献。
小鼠后续保种
基因敲除小鼠得来不易，如果顺利构建一只基因敲除鼠就需4-6个月，可见周期的冗长。因此，在实验结束后一般会将这些基因型小鼠长期保存下来方便后面使用，常见的方式有冷冻精子和胚胎，它们与单纯饲养活体动物保存种质资源相比，可以大大降低饲养动物所占用的经费、时间和空间，同时可避免饲养过程中基因的丢失。
参考文献：
1. Guan Y, Ma Y, Li Q, Sun Z, Ma L, Wu L, et al. CRISPR/Cas9‐mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse. EMBO Molecular Medicine. 2016;8(5):477-88.
2. Jakob B, Kochlamazashvili G, Jäpel M, Gauhar A, Bock HH, Maritzen T, et al. Intersectin 1 is a component of the Reelin pathway to regulate neuronal migration and synaptic plasticity in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017:201704447.
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