免疫组织化学技术
一、组织（细胞）标本取材及保存
（一）组织标本取材和保存
活检标本：活检标本和内窥镜及穿刺组织，立即用生理盐水液TBS冲洗几次，除去血液；制石蜡切片需放入固定液内，并标上来源及检查内容
手术切除标本：一般较大，抗原在组织中分布不均匀，故取材要取：主要病灶、病灶与正常组织交界处、远离病灶区的正常组织、大小1*1*0.3厘米（冰冻切片厚可达0.4~0.5厘米），非冰冻切片的组织固定、脱水，应在室温中4℃进行，冰冻切片保存在-20℃
组织标本应在低温下冻存。新鲜组织可先置4℃生理盐水不超过2~6小时及时速冻。防止冰晶形成。常用丙酮干冰法、液氮法、低温冷冻法。若冰冻组织块较多，应标号立卡，取用时应入37℃加温速溶。
（二）细胞标本取材和保存
印片法：活检中手术标本
将新鲜标本从病灶中心切开，将病灶区轻压于载玻片上，细胞附着在载玻片上，吹干，将载玻片立即浸入细胞固定液3~5分钟，取出，干燥，低温贮存。
沉淀法：胸水、腹水、尿液等体液多而细胞较少的标本
标本内细胞数较多。液体混浊，用吸管吸取少量液体直接涂片；细胞较少，可吸瓶底自然沉淀液6毫升，高速离心，弃上清，将沉淀涂片。
穿刺抽吸法：淋巴结、软组织、肾、肝、肺等用细针头穿刺的组织
如穿刺细胞较少，直接涂片，力求细胞分布均匀。
穿刺物较多，细胞丰富，可滴入盛有Hank液1~2毫升的 试管内，轻轻搅拌，低速离心，弃上清，取沉淀涂片，稍干，固定。
细胞涂片时注意：载玻片涂上粘附剂，防止细胞脱片；细胞集中在6~10毫米范围内，细胞总数以105个为宜；富于黏液的标本如痰液、胃液等，需经处理后再作免疫组化标记。
二、固定
较好的固定液：
有保存抗原的完整性，防止抗原弥散；
不影响抗原抗本反应；
保留良好的组织形态和结构；
方便。
（一）甲醛
包括：
10%福尔马林溶液：甲醛10毫升，自来水90毫升
10%中性福尔马林溶液：10%福尔马林含饱和碳酸钙
10%中性缓冲甲醛液：40%甲醛液10毫升加0.01M(pH7.4)PBS90毫升。组织穿秀好，收缩性小，对IgM、IgA、κ 链和λ链的标记效果良好，对分子小的抗原如激素、肽类等，效果好且背景清晰
10%甲醛盐溶液：40%甲醛10毫升，生理盐水90毫升
甲醛能有效保护某些抗原，能较好保持组织形态结构完整
经甲醛固定的组织，大多数抗原在免疫染色前必须经蛋白酶消化，打开抗原决定簇，使阳性强度明显提高。固定一般不超过24小时
（二）Bouin液
饱和苦味酸（过滤）750毫升，40%甲醛250毫升，冰醋酸50毫升
对组织穿透力较强，固定较好，结构完整
其pH3.0~3.5，对抗原有一定损害，且组织收缩较明显
常用于标记B细胞、癌胚抗原、甲胎蛋白等
染色前用50~70%酒精 洗涤除去苦味酸
（三）丙酮
组织渗透性和脱水性更强
常用于冰冻切片或细胞涂片的后固定
能较好保存其抗原性
将细胞涂片或冰冻切片浸入冷丙酮液10分钟，取出，自然干燥，贮存于低温冰箱内备用
采取较低浓度的固定液和最短固定时间
尽早固定；组织块尽量小小于2*2*0.4厘米）；固定后充分冲洗；选择最佳的固定方法
（四）脱水、透明、浸蜡和包埋
脱水、透明在4℃或室温下进行，避免组织抗原损失；
组织块厚度1~1.5厘米，使组织充分脱水、透明和浸蜡；
浸蜡和包埋时，石蜡温度保持在60℃及以下，用熔点低的石蜡包埋；
在较低温度下制作蜡块，试剂处理时适当延长，否则会切片困难，脱水不完全可直接造成免疫染色的脱片或影响效果。
（五）石蜡切片
载玻片处理：新的载玻片经清洁液浸泡，流水漂洗过夜，用蒸馏水清洗，浸泡在95%酒精，用绸布擦干，贮存在玻片盒里
清洁的载玻涂粘附剂：
进口切片粘附剂，按10%稀释直接涂片；
明胶明矾混合液：明胶、明矾各1克加入1%甘油100毫升，加热至70℃，熔化后搅拌混合成完全透明状，把切片浸泡其足几分钟，贴片；
合成乳胶-聚蜡酸乙烯乳液：合成乳胶10份，蒸馏水90份，浸泡3分钟，干后备用；
甲醛明胶：1%明胶5毫升，2%甲醛5毫升，混合后涂片
效果比较：
明胶明矾液最佳，不受时间、条件限制，一般不会增加背景染色；
合成乳胶透明度相通较差，乳胶遇乙醇解聚，不适于冰冻切片；
甲醛明胶粘附效果较差；
进口切片粘合剂价格较贵
石蜡切片不如冰冻切片保存抗原完好，但组织细胞形态结构清楚，可进行回顾性研究，适合于大多数抗原。注意：
长带状连续切片按顺序分离成单片，并依次贴在载玻片的同一位置；
切片位置距载玻片一端至少1厘米，一般切片可靠一边以利显色；
包埋蜡用52~56℃石蜡，切片水温低于常规切片；
切片刀、刀片锋利，切成的切片无刀痕，厚度4~5微米；
细心烤片，抗原性较强的组织在60℃温箱内烤3~8小时，抗原较强的可在37℃浊相过夜；
切片如需长期保存，可存放于4℃或室温，脱蜡后不能在4℃保存。
冰冻切片：最大限度保存抗原
一般-20~-25℃，厚8~14微米，切片平整，组织冻裂或冰晶形成而影响观察时，可先将组织解冻后再速冻切片
附：LEICA1900-1冰冻切片机组织冷冻温度参考表
LEICA1900-1冰冻切片机切片故障处理
二、免疫组织化学染色
（一）实验设计
根据课题列出免疫指标，预实验，观察能否表达预期目的及预实验中摸索出抗体最佳稀释度、消化时间，根据内源性酶多少决定抑制物种类和浓度、各种抗体最佳孵育温度及时间，才能大批量染色。
临床病理诊断和鉴别诊断：
对常规组织切片仔细观察，选择疾病本质的组织标本，如肿瘤组织切片，应挑选肿瘤细胞丰富、无出血变性坏死和炎症区域，以免影响组织切片的免疫染色；
初步观察后，缩小肿瘤鉴别诊断范围，有目的地选择抗体，以免浪费时间和试剂；
根据试验要求选择免疫染色方法，设阴性、阳性和空白对照；
每次实验严格按照计划操作，万一染色失败，便于找出原因；
每张切片标出号码和抗体名称，防止混淆；
出现染色结果不肯定时，应重复实验一次。
（二）内源性酶和内源性生物素阻断
内源性过氧化物酶：主要见于红细胞(Red blood cell)的血红蛋白(Hemoglobin,Hb)、中性粒细胞(neutrophil)的髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）及单核细胞（monocyte）、嗜酸性粒细胞(neutrophil)和组织内的过氧化物酶(Peroxidase,POD)
阻断方法：
3%过氧化氢（hydrogen peroxide）：最快、最简单、最常用。直接滴或浸泡切片5~10分钟。不适用于细胞涂片和冰冻切片
0.3~0.5%过氧化氢-甲醇（木醇、木精，Methanol）：浸泡切片15分钟
盐酸酒精液：无水酒精（ Absolute alcohol）100毫升含盐酸（Hydrochloric acid）0.2毫升。浸泡切片15分钟
1%硝基氰化铁钠（硝普钠，Sodium nitroferricyanide）-2%醋酸（Acetic acid）-无水甲醇液：浸泡15分钟
内源性碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP,ALP)：主要见于中性粒细胞和内皮细胞
阻断：1%左旋咪唑（Levamisole）
内源性生物素：肝、胰、肾等脏器的细胞含有许多生物素(维生素H,Vitamin H)或类生物素物质，与卵白素（亲和素、抗生素蛋白，Avidin）生成非特异性染色。
阻断方法：将切片置于卵白素（25微克/毫升）浸泡1分钟，用缓冲液洗净，移至生物素饱和液浸15分钟，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液
（三）蛋白酶消化
是否要酶消化取决于组织抗原及抗原在切片中的封闭程度
需要消化的切片应根据其性质及分布选择不同的酶和消化时间
胰蛋白酶（Trypsin ）：最常用，极少破坏组织且反应易控制。一般浓度为0.05~0.1%（取胰蛋白酶0.05克或0.1克加入0.05%或0.1%pH7.8无水氯化钙溶液中溶解），消化时间37℃ 10~40分钟，陈旧组织可延长消化时间
胃蛋白酶（Pepsin）：0.4%胃蛋白酶（0.1N HCl配制），消化37℃ 30~180分钟。主要用于细胞间质抗原显示
链蛋白酶（Pronase ）：0.1%，溶于0.5M pH7.5 Tris-HCl缓冲液中，消化1~4小时
尿素（urea）：提高抗原抗体反应，尤其用于单克隆抗体的石蜡切片，有时比蛋白酶消化效果好。3M尿素水溶液处理5分钟
酶消化温度为37℃，胰蛋白酶最佳pH7.6，要求钙离子激活时，37℃才能达到最佳效果
胃蛋白酶在酸性条件下达到最佳效果
酶消化的切片务必充分洗涤，否则对抗原组织缓慢消化，影响抗体结合，破坏组织结构；阴性、阳性对照也应消化。避免人为差异
（四）抗体稀释度
合适的抗体稀释度：抗体浓度大大高于抗原浓度，导致抗体结合减少而产生 阴性结果
使用一系列稀释度检测抗体的合适稀释度
最佳稀释度：各种标本抗原浓度强弱不一，选择合适稀释度对抗原性强的组织会造成背景染色加深；对抗原性较强的标本而言，会引起假阴性反应
根据不同情况适当高速稀释度，力求出现强的阳性着色和弱背景着色，即最佳稀释度
影响抗体稀释度的因素
抗体效价：与抗体浓度成正比。每毫升溶液内抗体分子越多，抗体效价越高
抗体溶液中的非特异性蛋白：造成非特异性背景着色。需高度稀释。
孵育时间：抗体稀释度越高，孵育时间延长，但较长会使脱片、组织结构破坏。一般室温孵育2~4小时或37℃1小时，4℃过夜
染色方法：为同方法使用不同稀释度见面会敏感性越强稀释度越高
