小鼠皮肤组织细胞悬液制备流程

背景介绍

小鼠皮肤组织和人皮肤组织差别不大， 在这个实验操作方案中我们主要使用由地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶来解离组织。地衣芽孢杆菌蛋白酶是一类丝氨酸内蛋白酶，对天然和变性蛋白具有广泛的特异性，在碱性条件下具有活性。

小鼠皮肤组织图片及示意图

实验仪器及耗材

B. Lich 酶解液(每23 mg 组织加入1mL)

• 100 μL b. lich 100 mg/mL (10 mg/mL final) +1 μL 0.5 M EDTA+899 μL DPBS

实验步骤

1. 分离组织并保存在低温保存液中。

2. 使用手术刀刮净皮下脂肪以及结缔组织。

3. 将皮肤组织在培养皿中预冷3~4分钟后使用剃须刀刀片彻底切碎，该操作在冰上进行。

4. 取23mg切碎的组织在1mL B. Lich 酶解液中，在冰上孵育。（PS. B.Lich酶解液配置参见实验试剂耗材一栏）

5. 每分钟摇晃一次；每2分钟使用刀片切割10次，总共进行20分钟。

6. 在冰上搅拌20分钟后，用移液管将消化混合物转移到2mL的均质器中。使用杵棒A搅打2 min (共4个循环，8分钟)。消化液此时会变得混浊。

7. 使用移液管将消化液转移到1.5mL离心管中，混合均匀后在冰上静置2分钟。

8. 保存700μL上清液，沉淀留在管底；取一个适用15mL离心管的30μm过滤器，用5mL的PBS/BSA 0.04%冲洗过滤器。过滤后的溶液在冰上保存，过滤器用于接下来的第二次消化过程。

9. 在步骤8留下来的沉淀中加入1mL B. Lich酶解液。

10. 每2分钟研磨10次，每分钟摇动一次，同时在冰上再孵育20分钟。

11. 将得到的所有上清使用过滤器过滤，并收集滤液。最后再用步骤8中保存的5mLPBS/BSA 0.04%冲洗过滤器。

12. 4℃，300g，离心5分钟。取上清液，用100µL PBS/BSA 0.04%重悬。使用台盼蓝进行细胞计数。

13. 通过细胞计数仪检测细胞活性大于等于85%，背景干净，结团率小于5%，细胞量大于等于5万；可用于后续单细胞测序建库实验。

制备结果

注意：皮肤细胞悬液制备中容易出现结团率偏高的情况。我们可以通过DNAseI和其他类型胶原酶辅助解离降低结团率，或者通过结团细胞团和单个细胞间沉降系数差进行离心沉降，从而获取低结团的细胞悬液。再者需要保证足够的解离时间，解离时间较短或者机械辅助不足时获取的角质层细胞比例较高。