mTORC1对雄激素受体的磷酸化促进肝脏脂肪变性和肿瘤发生
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研究背景：
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤,。HCC的一个主要危险因素是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），其主要是由过量的高糖和脂肪摄入引起的。肝细胞癌还有着明显的性别差异，肝癌的男女比例在2:1到7:1之间，与病因、种族和地理无关。虽然HCC中的性别差异已得到公认，但其潜在的分子机制仍知之甚少。雄激素受体（AR）是类固醇激素受体超家族的成员。雄激素刺激前列腺细胞后，AR迁移到细胞核中，与靶基因启动子中的雄激素反应元件（ARE）结合并控制其表达。AR是前列腺癌的既定驱动因素和治疗靶点。它也被认为在男性偏倚的肝癌中起作用。既往研究认为AR介导乙型肝炎病毒（HBV）依赖性肝癌的发生，但这不能完全解释病毒性和非病毒性HCC中存在的性别差异。雷帕霉素（mTOR）的机制靶点是一种高度保守的蛋白激酶。可以形成两种不同的复合物：mTORC1和mTORC2。mTORC1是营养信号的主要调节者，也是细胞生长和代谢的控制器。mTORC1的慢性过度激活是肥胖发生的基础。同样mTORC1信号增强也是NAFLD和HCC的主要原因。作者先前发现AR在人类HCC临床样本中过度表达和激活，且与不良预后相关。并且由于mTORC1在肝癌细胞中AR的稳定性和核定位起到重要作用。但目前尚不清楚mTORC1是如何调节肝脏AR的。因此在本文中，作者发现了肝脏AR是mTORC1的直接靶点。同时mTORC1通过S96磷酸化调节AR的稳定性和活性，促进体外新生脂肪生成和细胞增殖，以及体内肝脂肪变性和肿瘤的发展。此外，临床样本中S96磷酸化水平升高与肝脂肪变性、HCC进展和不良预后相关。
研究结果：
1.有丝分裂和营养信号对肝脏AR的调节
先前研究发现AR是mTORC1信号的下游靶点。由于mTORC1是促有丝分裂和营养信号的控制器，为了探究肝脏AR活性是否对肝细胞中的促有丝分裂和营养刺激有反应。为此，作者使用雄激素反应元件（ARE）控制下的荧光素酶报告实验来测试AR活性（图1A）。在HCC SNU449和SNU423细胞中，胎牛血清（FBS）或葡萄糖（G）饥饿处理显著抑制AR的转录活性，但氨基酸（AA）处理不抑制其活性（图1B）。同样， FBS和G饥饿处理也导致AR蛋白水平下调（图1C）。缺乏FBS和G（而非AA）也会减弱HCC细胞中R1881对ARE荧光素酶报告基因的激活能力（图1D和1E）。与作者之前的观察结果一致，雷帕霉素在没有或存在R1881的情况下同样抑制报告酶活性和蛋白质表达（图1F），上述结果表明AR选择性地响应葡萄糖和有丝分裂信号的刺激，独立于雄激素并与雄激素协同作用。
图1.
2.mTORC1与AR相互作用并以非激素依赖的方式调节AR磷酸化
为了探究mTORC1是否在调节AR中起直接作用，作者通过共同免疫沉淀（co-IP）研究了内源性AR和mTOR可能的相互作用。结果表明，当AR免疫沉淀时，检测到了mTOR，但在IgG对照中未检测到mTOR（图2A）。相反，当mTOR免疫沉淀时，在抗mTOR IP中检测到AR，但在IgG对照IP中未检测到AR（图2A）。表明二者之间存在相互结合作用，作者接下来用免疫荧光法进一步研究了AR和mTOR的亚细胞定位，以及它们在完整HCC细胞中的相互作用。发现AR和mTOR分别主要分布在细胞核和细胞质中（图2B）。但AR-mTOR相互作用似乎主要在细胞质中（图2C）。这些结果表明，mTOR和AR存在特异性地相互作用。
由于mTOR是一种通过磷酸化调节下游效应器的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因此作者进一步探讨了mTOR1是否通过磷酸化调节AR。作者发现，雷帕霉素处理30分钟后，HA-AR的电泳迁移率显著增加（图2D）。用λ磷酸酶（λpp）处理也增加了HA-AR的电泳迁移率（图2E和2F），表明HA-AR的慢电泳带是高磷酸化形式，快电泳带是低磷酸化形式。相反，R1881不影响HA-AR的电泳迁移率以及λpp或雷帕霉素诱导的电泳迁移率变化（图2E和2F）。综上所述， mTORC1以非激素依赖的方式调节AR磷酸化。
图2.
3.mTORC1在体内调节S96的AR磷酸化，在体外调节S96的磷酸化
为了确定AR的磷酸化位点是否受mTORC1调控，作者对从SNU449细胞分离的AR蛋白进行了MALDI-TOF/TOF质谱分析。结果显示AR蛋白上有几个主要的磷酸化位点，包括S96、S215、S258、S310和S650。为了精确定位特定的mTORC1依赖位点，作者将HA-AR的五个丝氨酸残基分别突变为丙氨酸或谷氨酸。发现只有HA-ARS96E和HA-ARS96A在电泳迁移率上表现出显著差异，这分别类似于高磷酸化和低磷酸化形式（图3A）。重要的是，S96A和S96E突变体在雷帕霉素处理后不再发生电泳变化（图3B）。这些结果表明S96是mTORC1依赖的磷酸化位点。S96在不同哺乳动物中高度保守，含有S96的肽序列符合mTORC1共有底物位点（图3C）。因此作者定制了p-S96特异性抗体，它可以识别HA-AR，但不识别HA-ARS96A或HA-ARS96E。发现雷帕霉素通过抑制mTORC1抑制S96的磷酸化（图3D）。相反，TSC1敲除激活了mTORC1进一步刺激了S96的磷酸化（图3E）。为了探究mTOR是否可以直接磷酸化S96，作者采用免疫沉淀mTOR，并以野生型AR肽为底物，以S96A突变肽为对照进行体外激酶测定。作者发现mTOR使野生型肽磷酸化（图3F）。综上，这些结果表明mTORC1是一种ARS96激酶。
图3.
4.S96磷酸化调节AR活性、亚细胞定位和稳定性
为了了解S96磷酸化在调节AR中的作用，作者在HCC细胞中构建了WT和HA-AR突变蛋白，并研究其激活ARE荧光素酶报告基因的能力。结果表明，ARS96A的转录活性显著低于WT AR，而ARS96E的转录活性显著高于WT AR（图4A），这表明S96磷酸化可激活AR。同时R1881增强了WT和突变AR的转录活性（图4A），表明mTORC1依赖的S96磷酸化和雄激素独立且协同调节AR活性。此外，S96突变体的转录活性不再对雷帕霉素处理有反应（图4B），表明S96磷酸化介导mTORC1依赖性调节以及雷帕霉素抑制作用。作者先前发现mTORC1可促进AR核定位。因此，作者研究了S96磷酸化是否在这种调节中起作用。发现HA-ARS96A主要存在于细胞质，而HA-ARS96E几乎完全存在于细胞核（图4C），表明S96磷酸化可调节AR核定位。由于雷帕霉素加速AR的蛋白酶体降解。为了了解S96磷酸化是否控制AR的稳定性，作者用放线菌酮（CHX）处理HCC细胞以阻断新的蛋白质合成，并通过免疫印迹法测定WT和突变HA-AR蛋白的蛋白质稳定性。结果表明，HA-ARS96E和HA-ARS96A分别比WT HA-AR更稳定和更不稳定（图4D）。因此，S96磷酸化介导mTORC1调节以促进AR蛋白稳定性。在SNU449细胞中使用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，无论是否使用雷帕霉素处理，都能显著稳定AR蛋白（图4E）。同样，HA-ARS96E的多泛素化水平低于WT HA-AR，而HA-ARS96A的多泛素化水平高于WT HA-AR（图4F）。因此，S96磷酸化可以抑制AR多泛素化和蛋白酶体降解。
图4.
5. S96磷酸化激活AR促进肝癌细胞脂肪生成
mTORC1通过激活SREBP1增强从头脂质生物合成从而促进肝脏脂肪变性和肿瘤发生。雷帕霉素处理显著下调SREBP1和脂肪酸合成酶（FASN）（图3D-3E）。为了确定AR是否在HCC的脂肪酸代谢中起作用，作者分析了由373例原发性HCC肿瘤样本组成的TCGA转录组数据集。发现AR高表达在HCC肿瘤组织脂肪酸代谢途径富集（图5A）。为了确定AR是否直接调节SREBP1的表达，作者进行了染色质免疫沉淀实验（ChIP），发现HA-AR与SREBP1启动子特异性结合（图5C）。接下来，作者在双荧光素酶报告系统中，使用荧光素酶（Luc）报告子检测SREBP1启动子对AR的反应活性。与WTHA-AR相比，HA-ARS96E增加了SREBP1Luc报告活性，而HA-ARS96A降低了SREBP1 Luc报告活性（无论R1881是否存在）（图5D）。作者进一步测量了WT和突变HA-AR的SNU449和SNU423细胞中的生脂基因（SREBP1、FASN、S1P、S2P、ACLY和SCD1）的mRNA表达水平。结果表明，与WT HA-AR相比，HA-ARS96E而非HA-ARS96A强烈刺激了产脂基因的表达（图5E-5F）。这些观察结果表明AR是新生脂肪生成途径的转录激活剂，S96磷酸化刺激AR依赖性脂肪生成。
图5.
6. AKT信号促进小鼠雄性偏性肝脂肪变性和肿瘤发生
AKT-mTORC1信号通路是HCC的主要致癌途径。通过水动力转染（HDT）在肝细胞中构建稳定表达的HA-AKT，在小鼠中以mTORC1依赖性方式导致HCC的发生。在这种小鼠模型中，表达AKT的雄性小鼠比表达AKT的雌性小鼠发生肝肿瘤的速度要快得多。AKT雄性组的平均生存时间约为HDT后8周，而AKT雌性组的平均生存时间为HDT后12周（图6A-6B）。作者通过肝脏/体重和单个肿瘤的大小判断，AKT雄性组的肿瘤发展更为强劲。例（图6C-6D）。在HDT后约15周，AKT雌性组在HDT后9周出现与AKT雄性组相似的肿瘤负担（图6E-6F）。接下来，作者对来自不同实验组的肝组织进行了分子和组织学分析。在模型后期，在雌性小鼠（第9周）的癌前病变或肝组织中，以及在雄性小鼠（第9周）和雌性小鼠（第15周）的肝肿瘤结节或肝组织中观察到AKT表达或阳性（图6D、6F）。与对照载体组相比，AKT表达性别组的AR-S96和AR的磷酸化水平也显著增加，表明AKT表达导致mTORC1信号激活和与之伴随的AR磷酸化。这些观察结果与作者的体外数据一致，即S96磷酸化与雄性激素协同激活AR和AR依赖性脂肪生成和增殖，这可能促进雄性偏性肝脂肪变性和肿瘤的发生。
图6.
7.AR以S96磷酸化依赖的方式促进小鼠肝脏脂肪变性和肿瘤发生
尽管AR在人肝癌中过度表达，并且其过度表达在体外和体内促进肝癌细胞增殖，但磷酸化AR的致癌作用在体内尚未被检测。因此，作者为了评估磷酸化AR在HDT小鼠模型中的致癌潜力。作者通过在HDT小鼠中单独表达NRAS或与HA-AR或HA-ARS96A联合表达建立了小鼠模型（图7A）。在研究过程中，单独使用NRA不会引起小鼠肝脏的明显病理变化（图7）。但NRAS和HA-AR的共同表达导致肝肿瘤的发生，HDT后平均生存时间为18周（图7B-7D）。相反，NRAS和HA-ARS96A的共同表达未能诱导肝肿瘤发生或导致死亡（图7B-7D）。组织学分析表明，在HDT后21周，NRAS/HA-AR肝脏包含具有大脂质空泡的大肿瘤组织（图7E）。相比之下，NRAS和NRAS/HA-ARS96A组肝脏没有表现出明显的病理变化（图7E）。Ki67染色显示NRAS/HA-AR肝肿瘤高度增殖，油红染色显示严重脂肪变性，这在NRAS或NRAS/HA-ARS96A肝中并未见到（图7F）。SREBP1和FASN在NRAS/HA-AR肝脏中的表达升高，但在NRAS或NRAS/HA-ARS96A肝脏中没有升高（图7F）。这些结果表明AR是肝脏脂肪变性和肿瘤发生的驱动因素。因此，本研究也为预防人类NAFLD和HCC提供了潜在的靶分子。
图7.
研究结论：
mTORC1对AR的磷酸化独立并与雄激素协同驱动肝脏脂肪变性和HCC的发生和进展，这不仅解释了HCC的雄性偏倚现象，而且还为HCC的预防和治疗提供了靶分子和HCC患者的潜在生存预测因子。
校对：霍欣彤