Neuron：HepaCAM调控星形胶质细胞的自组织和偶联
星形胶质细胞广泛浸润神经纤维网，以调节神经突触发育和功能。该过程受星形胶质细胞和神经元之间的细胞粘附因子的跨细胞作用相互调节。HepaCAM（肝细胞粘附因子）又称为GlialCAM，是星形胶质细胞上表达极为丰富的一种细胞粘附因子，参与细胞间的相互作用，调节细胞迁移和增殖，通过在大脑中建立不同的非重叠区域，以协调星形胶质细胞形态发生和间隙连接偶合。
而星形胶质细胞如何协调彼此之间的发育过程，如何解析出突触神经纤维，使其不重叠发生尚未有深入研究。基于此，来自杜克大学的CaglaEroglu团队在《Neuron》杂志上发表了关于HepaCAM介导星形胶质细胞形态发育和互相调控作用的研究报道，旨在为部分白质病变的神经系统疾病寻找潜在的治疗靶点。
首先在小鼠初级视皮层（V1）发现星形胶质细胞中高表达HepaCAM，并且在星形胶质细胞接触处也有集中表达（图1a、b）。作者观察HepaCAM敲除后星形胶质细胞的形态变化（图1D），发现HepaCAM敲除（shHep）可以显著降低星形胶质细胞分支复杂度（图1E、F）和星形胶质细胞突起长度。
为了进一步确定HepaCAM是否在体内调节星形胶质细胞的形态发生，作者通过电穿孔（PALE）结合PiggyBac转座子系统标记星形胶质细胞。在不同的时间点，P7至P21观察，发现敲除Hepacam的星形胶质细胞的区域体积比对照组小（图1I和1K），但是星形胶质细胞向神经纤维浸润的体积没有改变（图1M-1O）。这些结果表明hepaCAM是发育中的小鼠大脑皮层星形胶质细胞正常生长和形态发生所必需的。
图1HepaCAM在体内调节星形胶质细胞的形态发生
为了研究HepaCAM调控星形胶质细胞形态发生的分子机制，在体外通过表达带有C末端标签的抗anshRNA人HepaCAM蛋白进行拯救实验。野生型（WT）人HepACAM抗体与shHep的共表达挽救了星形胶质细胞的形态复杂性（图2B、2C），而缺乏胞内结构域（ICD）则无法挽救（图2D、2F）。结果表明，HepaCAM的结构域对于星形胶质细胞的正常形态发生是必需的。
图2HepaCAM 通过细胞外和细胞内结构域调节星形胶质细胞形态发生
作者发现HepaCAM和Cx43共同定位于小鼠皮层的星形胶质细胞突起（图3b）。在与神经元共培养的星形胶质细胞中，Cx43基因敲除显著降低了星形胶质细胞的形态复杂性，与HepaCAM基因敲除相似，HepaCAM和Cx43的联合敲除（shHep shCx43）没有进一步降低星形胶质细胞的复杂性，提示HepaCAM和Cx43在体外通过同一途径调控星形胶质细胞的形态发生。
接下来，使用PALE结合PiggyBac转座子系统在小鼠视觉皮层中的稀疏星形胶质细胞群中敲除cx43。与hepaCAM基因敲除类似，CX43敲除的星形胶质细胞区域体积明显较小。在P21时，区域体积和浸润体积均显著降低，表明Cx43敲除可影响体内星形胶质细胞形态发生。
由于在HepaCamko小鼠的星形胶质细胞培养物中Cx43的膜定位被破坏，作者推测HepaCAM可能通过控制Cx43的定位或稳定性来调节星形胶质细胞的形态发生。
为了验证这一点，作者通过引入不同的shRNA抗性Cx43突变体结构来拯救shHep星形细胞的形态。实验证明，HepaCAM通过调节Cx43的表面稳定化来控制星形胶质细胞的形态发生，还发现CX43通过非通道依赖性机制来控制星形胶质细胞的形态发生，这种机制可能通过其粘附性介导。
作者发现，Hepacam缺失降低了星形胶质细胞的体积，但小鼠体内并没有发现细胞数量或皮质体积的变化。Hepacam可能参与了一种自我识别机制，调节了星形胶质细胞对区域的竞争，在这种情况下，相邻星形胶质细胞之间HepaCAM表达差异将导致星形胶质细胞区域体积的改变，但从所有星形胶质细胞中敲除HepaCAM是否可以保证区域体积保持不变。为了测试这种可能性，在HecaMwt和cKO小鼠的皮质中标记GFP-CAAX的星形细胞（图3C-3F）。在P21时间点观察，发现在HepacamWT和cKO星形胶质细胞之间的平均区域体积没有差异（图3C、3D）。
这些研究结果表明，HepaCAM需要在相邻的星形胶质细胞之间正确识别和建立区域（图3L），星形胶质细胞的发育可能依赖于HepaCAM的表达，通过自我识别机制来竞争区域。
图3 HepaCAM调节星形胶质细胞区域争夺
因为在体外发现了HepaCAM和Cx43之间的功能联系，接下来作者研究了Cx43在Hepacamko小鼠体内的定位，发现在ko小鼠中，Cx43点状突起的百分比显著高于星胶-星胶的接触位点，Cx43的定位表明HepaCAM控制Cx43定位在星形胶质细胞体内。为了确定Cx43定位改变是否与星形细胞间隙连接偶联的变化相一致，我们在L5视皮层的单个星形胶质细胞中注入神经生物素，与WT小鼠比较，在微血管内皮质星形胶质细胞之间的间隙偶联显著受损。这些结果表明Hepacam调节了Cx43的亚细胞定位。
为了确定星形胶质细胞中的HepaCAM是否是大脑发育中正常突触形成所必需的，作者对WT和HepaCamko小鼠的视皮层的突触密度进行了定量。发现抑制性突触在L1中的密度显著降低，在L5中没有降低（图4B-4E）。为了确定星胶Hepacam是否需要适当的突触功能，膜片钳记录了WT和cKO小鼠视皮层L5锥体神经元的微小抑制性突触后电流（mIPSCs）和微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）。在cko小鼠的神经元中，MIPSC的振幅显著降低，MEPSCs振幅增加，频率都没有变化（图4F–4J），这些结果表明，星形胶质细胞中的HepaCAM在调节小鼠皮层的抑制性和兴奋性突触强度方面起着关键作用。
图4 星形胶质细胞 hepaCAM调节抑制性突触形成和功能
作者的研究发现HepaCAM在发育的小鼠大脑皮层中有调节星形胶质细胞的形态发生和区域竞争。发育中的星形胶质细胞Hepacam的缺失可显著损害星形胶质细胞间的间隙连接和偶联，破坏突触兴奋和抑制之间的平衡。
Hepacam外区域（ECD）突变会导致巨头型白癜风性脑病伴皮质下囊肿（MLC），星形胶质细胞以及突触和间隙连接偶联表型对于理解神经系统疾病的病理生理学有重要意义。总之，该研究确定HepaCAM为连接星形胶质细胞-星形胶质细胞和星形胶质细胞-突触相互作用的分子链接，直接影响星形细胞功能障碍。此外，HepaCAM 中的致病突变是否会损害Cx43 功能对于确定靶向Cx43 是否可以成为MLC治疗策略是必要的。
‖ 参考文献
1. BaldwinKT, Tan CX, Strader ST, Jiang C, Savage JT, Elorza-Vidal X, ContrerasX, Rülicke T, Hippenmeyer S, Estévez R, Ji RR, Eroglu C. HepaCAMcontrols astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 2021 Jun21:S0896-6273(21)00378-0. doi: 10.1016/j.neuron.2021.05.025. Epubahead of print. PMID: 34171291.
投稿：原代美少女
审稿 悟空