【LorMe课堂】微生物之间是否也会出现欺骗和合作两难的困境？
作者：李玲，南京农业大学在读博士，主要研究土壤微生物生态。
创新没有捷径，如果有，那就是阅读高质量文献。LorMe课堂主要展示研究生课程文献研讨环节的作业。本期主题为铁载体，共有16名研究生在课堂上分享了文献阅读。本期由李玲博士生为大家带来苏黎世大学Rolf团队2017年发表在Nat Commmun上的文章。李玲同学非常认真，汇报非常清晰，对文章细节也把握的很好。谢谢她的贡献。
Rolf团队重点研究铁载体，2015年我在瑞士洛桑大学参加欧洲进化生物学和他简短交流，并聆听了关于这篇文章的大会报告。这篇文章的重要突破是研究了铁载体在群落水平互作，尽管还依然聚焦在假单胞菌。3年后，我带着我们关于土壤微生物群落铁载体与根际健康的研究结果去苏黎世大学拜访了他，参观了他的实验室，学习了很多。现在他成为了LorMe实验室重要合作伙伴，小邵的工作打算与他展开具体的合作。
导读
在土壤和池塘的假单胞菌群落中，由生长所必需的单一可共享化合物所介导的群落互动对竞争动力学有着重要的影响。作者发现非生产者和低生产者的铜绿假单胞菌铁载体共同存在于许多自然群落中。虽然非生产者有编码多种铜绿假单胞菌铁载体受体的基因并且能够利用来自其他群落成员的兼容的异源铜绿假单胞菌铁载体，但是生产者在分泌的铜绿假单胞菌铁载体类型方面存在差异，从而为其提供免受具有不相容受体的非生产者利用的保护。作者的研究结果表明，社会生物既有欺骗的选择（欺骗者），也有抵制欺骗的选择（合作者），这可以驱动自然细菌群落的拮抗协同进化和多样性。
天然菌株的铜绿假单胞菌铁载体生产水平不同
作者从8个土壤群落和8个池塘群落中总共分离到320株假单胞菌。研究对所有的分离株的rpoD基因进行了测序，确定315株分离株是假单胞菌。为了研究铜绿假单胞菌铁载体非生产者是否与同一群落的生产者共存，研究测量了铁限制的酪蛋白氨基酸（CAA）培养基中所有315株分离株的铜绿假单胞菌铁载体生产量。该分析显示，在16个群落中有14个群落发现了不产生或残留量的铜绿假单胞菌铁载体的菌株。进一步的研究发现，铜绿假单胞菌铁载体在生产时存在一个连续的特性，即生产水平从零到非常高（图1a,b）。所有群落中铜绿假单胞菌铁载体生产水平的变化都很高，表明非产量菌株及不同产量菌株通常共存。
图1铜绿假单胞菌铁载体生产和天然假单胞菌分离株的生长
在铁的限制下，铜绿假单胞菌铁载体对生长很重要
一些观点认为铜绿假单胞菌铁载体对这些假单胞体中的铁的获取非常重要，在CAA培养基中，分离物的铜绿假单胞菌铁载体含量与其生长呈显著正相关（图1c）。为了确定了铁限制CAA中生长的铜绿假单胞菌铁载体的量，研究进一步培养了补充有40µM FeCl3的CAA中的分离物。该实验揭示了所有菌株的显著生长，表明所有环境分离株都可以使用CAA作为营养源（图1d）。
将铜绿假单胞菌铁载体产量与系统发育关联
为了探索系统发育与铜绿假单胞菌铁载体产生之间的关系，研究构建了基于部分rpoD基因序列的最大似然系统发育树。研究为土壤和池塘栖息地构建了单独的发育树，并将菌株的铜绿假单胞菌铁载体生产位点映射到树上（图2）。池塘的绝对系统发育多样性显著高于土壤群落。相反，群落内系统发育距离的相对多样性在土壤和池塘之间没有差别，对于两个生境来说都很高。这些分析表明，假单胞菌一般生活在多样化的多菌种群落中。
图2基于部分rpoD序列的土壤和池塘分离株的最大似然进化分支图
铜绿假单胞菌铁载体上清液对受体生长的影响
研究进行了上清液测定，以测试生产者分泌的铜绿假单胞菌铁载体是否刺激或抑制不产生或很少产生铜绿假单胞菌铁载体的群落成员的生长。从每个群落中，作者选择了三种不生产或产生少量铜绿假单胞菌铁载体的菌株（以下称为受体），并用三种随机菌株（以下称为供体）的上清液喂养它们，其产生比受体更高量的铜绿假单胞菌铁载体。因此，每个受体用来自三个供体的含有铜绿假单胞菌铁载体的上清液喂养。该上清液测定显示供体上清液可以刺激和抑制受体的生长，其效果在从完全抑制到强刺激的连续体上变化（图3a）。上清液对生长的平均影响在土壤和池塘分离物之间没有显著差异。有趣的是，生长效应与土壤中受体和供体之间的系统发育相关性呈正相关，而与池塘群落中的不相关（图3b）。这一结果表明，土壤群落的受体往往受到更密切相关的菌株的刺激。另一方面，在池塘群落中，受体和供体对之间的相关性通常低于土壤，受体通常会受到远亲的刺激（图3b）。
上清液测定进一步揭示了显著的供体效应和一个接近显著的受体效应。这意味着供体的上清液通常对多个受体具有一致的（刺激的，中性的或抑制的）效果，并且类似地，受体通常受到外来上清液的影响，而无视供体的身份。
图3含有铜绿假单胞菌铁载体的外来上清液可对接收菌株的生长具有刺激，中性或抑制作用
铜绿假单胞菌铁载体对观察到的生长效应负责
研究检查了上述报告的刺激和抑制作用是否确实是由铜绿假单胞菌铁载体引发的。为了测试这一点，研究首先随机挑选了来自不同的土壤和池塘群落8个非生产者（4个分离株是完全非生产者，即相对铜绿假单胞菌铁载体产生与背景荧光无法区分；4个分离株产生残余量的铜绿假单胞菌铁载体）。然后研究在铁限制条件下培养每个非生产者，有或没有来自同一群落的生产者的纯化铜绿假单胞菌铁载体，这对上清液测定中的非生产者显示出刺激作用（图3）。研究发现两种检测方法完全匹配（图4）：从先前显示刺激的菌株中分离出的所有8种铜绿假单胞菌铁载体显著促进了非生产者的生长。这表明这8个非生产者拥有利用补充的异源铜绿假单胞菌铁载体的受体。
在下一个测定中，研究用相同的8个非生产者喂养来自生产者的纯化的铜绿假单胞菌铁载体，其在上清液测定中显示出中性（2例）或抑制性（6例）效应。在两种测定中，结果是一致的：从先前显示抑制的菌株中分离的铜绿假单胞菌铁载体显著损害了非生产者的生长。虽然在其余三种情况下匹配并不完美（图4），铜绿假单胞菌铁载体从未产生刺激作用。这些结果强烈表明这些非生产者缺乏吸收第二批铜绿假单胞菌铁载体的受体。在这种情况下，可能会出现生长抑制，因为不兼容的铜绿假单胞菌铁载体会锁住介质中的铁，从而进一步降低非生产者获得这种基本元素的可能性。
图4异源铜绿假单胞菌铁载体促进或抑制受体菌株的生长
直接竞争中的欺骗与欺骗阻力
上述结果表明，主要是铜绿假单胞菌铁载体在铁限制下驱动天然分离物之间的相互作用模式。因此，研究试图了解铜绿假单胞菌铁载体介导的生长效应（从刺激到抑制）如何影响菌株的竞争能力。因此，研究进行了16个直接成对竞争测定，其中研究将8个非生产者与其刺激或非刺激（中性或抑制）铜绿假单胞菌铁载体生产者混合。为了能够区分这两种竞争菌株，研究将组成型表达的适应性中性mCherry标记整合到非生产者的染色体中。
当作为单一培养时，非生产者的生长明显比生产者差（图5a）。这些生长模式表明，在限制铁的培养基中不生产铜绿假单胞菌铁载体是一种障碍。相反，在四对菌株的直接竞争中，适合度模式发生了逆转，在这些菌株中，非生产菌株可以显著地胜过它们的刺激菌株（图5b）。这表明非生产者可以通过成功开发生产者分泌的铜绿假单胞菌铁载体来充当欺骗者，从而获得相对优势。然而，研究的竞争分析还表明，使用异源铜绿假单胞菌铁载体的能力不一定足以获得相对优势，正如非生产者在与分泌兼容铜绿假单胞菌铁载体的生产者的竞争中失败的四个案例所证明的一样（图5b）。最后，研究发现在与生产者分泌一种不兼容的吡咯烷的混合培养基中，非生产者的表现更差，他们的竞争非常激烈（图5b）。
图5 铜绿假单胞菌铁载体生产者和非生产者间的直接竞争揭示了欺骗行为和对欺骗的抵制
铜绿假单胞菌铁载体介导的群落互动的遗传基础
来自铜绿假单胞菌铁载体交叉喂养和竞争测定的结果表明（图4,5）：（a）来自同一群落的生长刺激和非刺激性假单胞菌产生不同的铜绿假单胞菌铁载体；（b）非生产者具有异源铜绿假单胞菌铁载体摄取的受体；（c）非生产者的铜绿假单胞菌铁载体受体与非刺激性生产者的刺激受体更相似。为了测试这些假设，研究对铜绿假单胞菌铁载体交叉喂养和竞争测定中使用的24种菌株的全基因组测序。
研究首先比较了每个菌株的铜绿假单胞菌铁载体基因位点的组织结构，以及先前描述的假单胞体的结构。发现每个生产者都有一个完整的铜绿假单胞菌铁载体基因位点，包括编码铁饥饿sigma因子pvdS的基因、非核糖体肽合成装置、分泌所需的出口元素和摄取所需的受体。相反，四个完整的非生产者有一个高度截短的铜绿假单胞菌铁载体簇，其中编码合成机制的大基因组区域缺失。且铜绿假单胞菌铁载体和受体基因仍然存在于这些菌株中。因此，后一种菌株不能产生野生型数量的铜绿假单胞菌铁载体的原因必须在于调节元素的改变，就像进化的铜绿假单胞菌铁载体非生产者的情况如所发现的那样。装配分析显示，有两种类型的非生产者：具有截短的铜绿假单胞菌铁载体基因位点的结构非生产者和具有完整但基本上不活跃的基因位点的沉默的非生产者。
为了研究假设（a），研究使用在生产者中确定的非核糖体肽合成装配线来预测铜绿假单胞菌铁载体骨架的肽序列。分析表明，来自同一群落的刺激性和非刺激性生产者产生结构上不同的铜绿假单胞菌铁载体，这意味着每个非生产者在研究的分析中确实面临两种不同类型的铜绿假单胞菌铁载体。当关注铜绿假单胞菌铁载体摄取时，研究发现所有非生产者在其基因组中都有多个fpvA受体同源物。这一点支持假设（b），因为它表明非生产者（但也有生产者）似乎具备摄取异源铜绿假单胞菌铁载体的能力。考虑到许多fpvA同系物，研究进行了两次比较，以检验假设（c）。首先，研究比较了生产者的铜绿假单胞菌铁载体基因位点中编码的FpvA与非生产者中任何FpvA同源物的序列相似性。其次，研究分析了铜绿假单胞菌铁载体基因座（在残留的非生产者中）或接近其残留（在完全非生产者中）编码的FpvA序列与生产者中的任何FpvA同源物的相似性。两种比较均支持假设（c）：非生产者及其相应的刺激生产者之间的受体相似性高于非生产者和非刺激生产者之间。
总结
铜绿假单胞菌铁载体介导的欺骗和竞争铁在天然假单胞菌中普遍存在，并具有重要的适应性效果。由于通过铁载体铁清除在铁有限的栖息地细菌类群中无处不在的，因此铁载体介导的群落互动在许多生态系统中都很重要，并且很可能参与形成菌株多样性和群落动态。且其他微生物的群落特性可能发挥类似的作用。综上所述，为了充分了解微生物群落的组成和功能，不仅需要考虑非生物因素，还需要考虑微生物群落因素。
原文：Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron insoil and freshwater Pseudomonas communities
期刊：nature communications
DOI：10.1038/s41467-017-00509-4
作者：Elena Butaitė et al.