Science|基于Cas9的单细胞谱系分析揭示肿瘤转移机制
撰文丨十一月
责编丨酶美
肿瘤中细胞种群的详细发育过程可以对癌症进展中的关键事件发生比如转移扩散过程的时间和过程进行表征。肿瘤进展过程的从包括早期获得致癌突变到正常和恶性肿瘤细胞的转化以及转移定植到远处的组织之中、原发肿瘤与转移灶之间的关系以及最终适应性治疗方案等过程中的每一步都会留下清晰的系统发育特征。转移是研究癌症进展过程中一个特别关键的步骤，因为它是癌症相关死亡率的主要原因【1】。然而，由于转移时间本身是罕见、短暂并且随机发生的，想要进行实时监测是一件极具挑战性的任务。
为了能够对肿瘤转移过程进行分析和记录，美国加州大学旧金山分校Jonathan S. Weissman研究组、Trever G. Bivona研究组以及加州大学伯克利分校Nir Yosef研究组合作在Science发文题为Single-cell lineages reveal the rates, routes, and drivers of metastasis in cancer xenografts，通过建立一种基于Cas9的单细胞谱系追踪的技术对肺癌异种移植小鼠模型中的转移率、转移途径以及转移的驱动因素进行研究。
对于肿瘤转移过程的关键特征比如对转移的克隆性、时间、频率以及转移起源以及目的进行研究研究需要通过准确重建肿瘤和转移的系统发生树【2】。而谱系追踪技术正是为人们绘制相关细胞的谱系图，为探索生物过程如癌症进展和转移的系统发育原理提供了重要工具。经典的谱系追踪策略可以从肿瘤亚群的共享序列变异模式中推断出肿瘤祖先。但是这些传统的细胞谱系追踪的方式会受到自然突变数量的限制并且由于肿瘤取样、测序误差以及不同程度的肿瘤内异质性以及非中性突变的影响导致分析的准确性不足。
而最近一些关于基于Cas9的单细胞RNA测序细胞谱系追踪的技术为大规模、高精度研究肿瘤进展提供了可行的方案【2-4】。简单来说，Cas9切割特定的基因组位点，此处可以简称为“Target Site”，造成一个稳定的Insert/deletion（Indel）等位基因可以被后代细胞继承，随着细胞分裂，它们在其他部位积累更多Cas9诱导的indels，从而进一步区分连续的细胞分支。在谱系追踪实验结束时，通过测序从单个细胞中收集indel等位基因并与细胞状态的单细胞表达谱配对。然后利用回溯性追踪的计算方法重建系统发育树，对测序得到的indels进行亚克隆细胞关系进行建模（图1）。
图1 基于Cas9的细胞谱系追踪技术工作原理
根据这一思路，作者们建立了用于小鼠肺癌外植体转移过程追踪的Cas9细胞谱系追踪技术。该系统主要包括以下几个组成元素：1）用于实时成像的荧光素酶；2）产生遗传indel的Cas9；3）记录谱系信息目标位点的10个独特的条码副本，可通过单细胞RNA测序捕获表达转录本；4）3个sgRNAs引导Cas9到靶位点，从而开始谱系记录（图1）。
通过该方法作者们对小鼠肺癌外植体的细胞进行亚克隆细胞追踪，随后对测序结果进行重建系统发育树。作者们发现样本中系统进化距离和等位基因距离之间是一致的而且重建系统发育树准确地模拟了细胞间的系统发育关系。进一步地，作者们通过重建的系统发育树对转移过程进行推断和定量化的分析。另外，作者们希望对不同转移能力下的单细胞转录状态进行探究。通过比较匹配的转录本以及细胞谱系数据库，作者们发现不同转移行为对应着不同的基因表达，其中发现了很多已知与转移过程相关的基因也有一些在转移过程中未知功能的基因（图2）。这些被识别的基因可以驱动肿瘤侵袭性的产生，通过进一步地遗传操纵以及体外侵袭实验，作者们发现了KRT17意想不到的在体外和体内抑制转移表型的功能。
图2 与转移过程相关的基因
总的来说，作者们的工作建立了基于Cas9的细胞谱系追踪技术，为加深对肿瘤的传播和进展过程的理解提供了重要工具，同时为癌症生物学研究的其他方面提供重要信息。另外，其中发现的一些肿瘤转移驱动基因也为了解这些基因在肿瘤转移过程中的作用以及建立相应的临床治疗方案提供了线索。在癌症之外，该方法也为系统发育的基础研究提供了前所未有的分辨率和规模，大大增强对于系统发生过程的理解。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2021/01/21/science.abc1944.full
制版人：十一
参考文献
1.Chaffer, C. L. & Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science (New York, N.Y.) 331, 1559-1564, doi:10.1126/science.1203543 (2011).
2. Birkbak, N. J. & McGranahan, N. Cancer Genome Evolutionary Trajectories in Metastasis. Cancer cell 37, 8-19, doi:10.1016/j.ccell.2019.12.004 (2020).
3. Frieda, K. L. et al. Synthetic recording and in situ readout of lineage information in single cells. Nature 541, 107-111, doi:10.1038/nature20777 (2017).
4. Alemany, A., Florescu, M., Baron, C. S., Peterson-Maduro, J. & van Oudenaarden, A. Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing. Nature 556, 108-112, doi:10.1038/nature25969 (2018).