科研 | Cancers：C20orf27通过TGFβR-TAK1-NFκB通路促进结直肠癌细胞生长和增殖（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。
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背景：结直肠癌(CRC)是一种高发性恶性肿瘤，缺乏高效靶向药物，迫切需要寻找新的特异分子靶点。
方法与结果：本研究通过WST-1和克隆形成实验，发现功能未知蛋白C20orf27 (20染色体开放阅读框27)可以增强CRC细胞的生长和增殖。裸鼠成瘤实验证实C20orf27促进了CRC的生长。信号通路分析确定TGFβR-TAK1-NFκB通路介导C20orf27诱导CRC的进展，而使用NFκB抑制剂可以逆转这一进展。Co-IP实验表明C20orf27通过与PP1c (1型磷酸酶的催化亚基)相互作用而促进TGFβR-TAK1-NFκB通路的激活。
结论：我们阐明C20orf27通过TGFβR-TAK1-NFκBCRC通路促进CRC生长和增殖的功能作用和分子机制，表明C20orf27有潜力成为CRC候选治疗靶点和肿瘤标志物。
论文ID
实验设计
研究20号染色体上未知功能的基因，筛选CRC中高表达的基因；
构建稳定细胞株，体外探索其功能；
蛋白质组学筛选差异表达蛋白及调控的分子通路；
谱鉴定相互作用蛋白；
动物体内实验验证。
实验结果
1. C20orf27促进CRC细胞的生长和增殖
我们集中研究了人类基因组20号染色体上24个功能未知的基因，通过在Oncomine网站上搜索，我们发现24个基因中有8个基因在CRC中高表达。我们使用实时qRT-PCR技术比较了这8个基因在8个CRC细胞和一个正常肠上皮细胞(NCM460)中的转录水平(图S1A)，选择在癌细胞中转录水平高于正常肠上皮细胞的PRNP (prionprotein)和C20orf27构建过表达稳定细胞，通过WST-1实验评估其促进细胞增殖的能力(图1B-E)。然后，我们选择能够显著促进CRC细胞增殖的C20orf27作为靶基因，深入探讨其作用机制。
Western blot检测8种CRC细胞和1种正常肠上皮细胞中C20orf27蛋白表达水平(图S2A)，结直肠癌组织中C20orf27的表达明显高于癌旁组织(图S2B)。使用C20orf27低表达的HCT15和DLD-1细胞构建稳定过表达细胞系(图1A)，WST-1分析显示，与对照组相比，过表达C20orf27显著提高了细胞线粒体脱氢酶活性(图1B)。克隆形成实验显示，过表达C20orf27可促进HCT15和DLD-1细胞的克隆形成(图1C-D)。相反，我们使用C20orf27高水平的SW480和HT29细胞进行沉默实验，结果显示，与对照组相比，C20orf27沉默后线粒体脱氢酶活性(图1F)和克隆能力受到抑制(图1E)。这些数据表明C20orf27可以促进CRC细胞的生长和增殖。
图1 C20orf27在体外促进CRC细胞的生长和增殖
(A)Western blot检测HCT15和DLD-1细胞中C20orf27的过表达；(B) WST-1检测HCT15和DLD-1细胞中过表达C20orf27的吸光度变化；(C)和(D)测定HCT15和DLD-1细胞中过表达C20orf27的克隆形成能力；(E) Western blot检测C20orf27在SW480和HT29细胞株中沉默；(F) WST-1法检测C20orf27沉默后SW480和HT29细胞吸光度的变化；(G)和(H)测定SW480和HT29细胞中C20orf27沉默的克隆形成能力。
2. C20orf27通过NFκB途径调控细胞周期和凋亡
为了更好地了解C20orf27调控CRC的分子机制，我们使用基于DIA的蛋白质组学，筛选DLD-1/HCT15-NC和DLD-1/HCT15-C20orf27细胞的差异表达蛋白，然后使用IPA分析差异表达蛋白，显示NFκB通路在C20orf27过表达时上调(图2A)。为了验证C20orf27是否通过NFκB调控CRC的生长和增殖，我们检测了NFκB通路相关蛋白的表达。在HCT15和DLD-1细胞中，C20orf27过表达后p-IκB、p-p65、CyclinD1和Bcl-2表达升高，Bax和剪切体caspase3表达降低(图2B和图S2B)，而在SW480和HT29细胞中，C20orf27沉默与p-IκB、p-p65、CyclinD1、Bcl-2表达呈正相关，与Bax、caspase3表达呈负相关(图2B和图S2C)。这些数据表明C20orf27通过激活NFκB信号调节CRC细胞周期和凋亡。
然后我们用流式细胞术检测过表达C20orf27的细胞与对照组细胞G1期的变化，结果表明，C20orf27降低了细胞G1期，从而使细胞周期进入增殖状态。同样的结论在SW480和HT29沉默细胞和对照组中得到(图2C,D)。为了进一步阐明C20orf27对CRC细胞凋亡的影响，我们采用流式细胞术检测了奥沙利铂(L-OHP)治疗后48和72小时的细胞凋亡情况(图3A-B)。在HCT15和DLD-1细胞中，与对照组相比，C20orf27过表达，在48和72小时凋亡细胞数减少。在SW480和HT29细胞中，在奥沙利铂治疗48和72 h后，C20orf27沉默显著增加细胞凋亡。这些数据表明C20orf27通过激活CRC细胞中的NFκB通路调控细胞周期和凋亡，从而影响细胞生长和增殖。
图2 C20orf27通过NFκB途径调控细胞周期
(A)利用IPA分析DLD-1/HCT15-NC和DLD-1/HCT15-C20orf27细胞的差异表达蛋白；(B) Western blot检测C20orf27过表达或沉默细胞中p-IκB、p-p65、CyclinD1、Bcl-2、Bax和caspase3的表达；(C)流式细胞术分析C20orf27过表达和沉默细胞的细胞G1期。
图3 C20orf27通过NFκB途径调控细胞凋亡
(A) 40 μM L-OHP预处理细胞48或72 h，流式细胞仪分析C20orf27过表达和沉默细胞的凋亡情况；(B)凋亡细胞百分比分析。
3. NFκB抑制剂逆转C20orf27在CRC细胞中的促生长作用
然后我们使用NFκB通路抑制剂Bay11-7082进一步阐明NFκB与C20orf27的关系，WST-1结果显示，从第3天开始，Bay11-7082抑制了C20orf27过表达细胞增加的生长活力(图4A)。p-IκB、p-p65、CyclinD1和Bcl-2蛋白证实Bay11-7082在C20orf27过表达细胞中成功抑制NFκB通路(图4B)。如图4C所示，Bay11-7082也显著抑制过表达C20orf27的细胞的克隆增殖。随后，我们还发现Bay11-7082可增加HCT15-C20orf27和DLD-1-C20orf27细胞的G1期(图4D)。C20orf27对细胞凋亡的抑制作用在奥沙利铂治疗HCT15和DLD-1过表达C20orf27细胞72h后被逆转(图4E)。总的来说，这些数据表明C20orf27通过NFκB通路调控细胞周期和凋亡，从而促进CRC细胞生长和增殖。
图4 NFκB抑制剂逆转C20orf27在CRC细胞中的促生长作用
(A) WST-1分析细胞增殖活性；(B) Western blot检测p-IkB、p-p65、CyclinD1、Bax、Bcl-2的表达；(C)克隆形成测定细胞克隆增殖能力并定量；(D)流式细胞术分析细胞周期并定量；(E) 40 μM L-OHP和10 μM Bay11-7082预处理细胞72 h，流式细胞术分析C20orf27过表达细胞的凋亡情况。
4. C20orf27与PP1c相互作用通过TGFβR-TAK1通路而激活NFκB
为了进一步阐明C20orf27激活NFκB通路的机制，我们采用Co-IP技术寻找与C20orf27相互作用的蛋白质。如图S2D所示，找到与C20orf27相互作用的37 kDa的蛋白。根据质谱结果，此蛋白为1型磷酸酶的催化亚基(PP1c)。为了进一步确定C20orf27是否与PP1c相互作用，将C20orf27与PP1c质粒转染HCT15和DLD-1细胞，Co-IP结果证明C20orf27与PP1c之间存在相互作用(图5A)。
为了进一步支持这一结论，我们将HA标记的PP1c质粒瞬时转染到C20orf27-Flag过表达或不过表达的细胞中，然后进行Co-IP检测，如图5B所示，PP1c与调控亚基GADD34的相互作用在C20orf27过表达后降低。因此，我们认为C20orf27通过与PP1c结合抑制PP1c进入其调控亚基，从而抑制PP1的磷酸酶作用。
在哺乳动物中，受体丝氨酸苏氨酸激酶家族是TGF(转化生长因子)家族配体的受体。磷酸化TGFβR诱导TAK1、IKK、IκBa以及RelA的磷酸化，并且TAK1增强NFκB激活。同时，我们证实TGFβR-TAK1-NFκB通路相关蛋白质的磷酸化状态，如图5C, HCT15和DLD-1细胞中C20orf27过表达，p-TGFβR、p-TAK1、p-IKK、p-IκB、p-p65的表达增加。相反地，在HT29和SW480细胞在C20orf27沉默，p-TGFβR、p-TAK1、p-IKK、p-IκB、p-p65的表达减少。这些数据表明，C20orf27通过与PP1c结合而抑制PP1全酶的形成，从而抑制PP1对TGFβR-TAK1-NFκB通路的抑制作用。换句话说，C20orf27激活TGFβR-TAK1-NFκB通路，促进CRC细胞生长和增殖。
图5 C20orf27与PP1c相互作用激活TGFβR-TAK1通路
(A) Co-IP验证PP1c与C20orf27的相互作用；(B)将HA标记的PP1c质粒转染C20orf27-Flag过表达或不过表达细胞，Co-IP实验证明过表达C20orf27降低PP1c与GADD34的相互作用；(C) Western blot检测C20orf27 过表达和沉默细胞中p-TGFβR、p-TAK1、p-IKK、p-IκB、p-p65的表达。
5. C20orf27在体内促进肿瘤生长
为了进一步证实C20orf27促进CRC生长的作用，我们还进行了裸鼠皮下形成肿瘤的体内实验。与对照组相比，经皮下注射细胞后，稳定表达C20orf27的CRC细胞的肿瘤生长能力更强(图6A-C)，如图6B所示，我们在裸鼠肿瘤细胞中检测了NFκB通路相关蛋白，结果显示，C20orf27与p-IκB、p-p65、CyclinD1和Bcl-2表达呈正相关，与体外实验结果一致。相反，C20orf27稳定沉默的CRC细胞与对照组相比，其肿瘤生长能力较弱(图6D-F)。这些结果说明C20orf27在CRC肿瘤形成和生长调控中发挥作用。
图6 C20orf27在体内促进肿瘤生长
(A)皮下注射过表达C20orf27细胞和对照细胞后小鼠肿瘤的形成；(B)肿瘤组织的Western blot分析；(C)实验期间过表达C20orf27细胞及对照细胞的裸鼠肿瘤体积；(D)皮下注射沉默C20orf27细胞和对照细胞后小鼠肿瘤的形成；(E)肿瘤组织的Western blot分析；(F)实验期间沉默C20orf27细胞和对照细胞的裸鼠肿瘤体积。
讨论
CRC仍是严重威胁人类生命的恶性肿瘤。因此，我们有必要继续开展肿瘤标记物和关键基因的研究，以诊断和治疗CRC。在本研究中，我们鉴定了人类基因组20号染色体上功能未知的基因C20orf27，并研究了其在CRC发生发展中的作用及调控机制。我们发现过表达C20orf27促进了CRC细胞的生长和增殖，而沉默C20orf27降低CRC的克隆形成和生长能力。进一步分析表明，C20orf27通过激活CRC中的NFκB通路调控细胞周期和凋亡，从而促进细胞增殖。然后我们发现C20orf27通过与PP1c相互作用而抑制TGFβR-TAK1-NFκB通路中 PP1全酶的作用，从而激活NFκB(图7)。CRC细胞皮下注射到裸鼠的实验证明C20orf27促进肿瘤形成和生长。
图7 机制示意图
(A) PP1c和GADD34相互作用抑制TGFβR-TAK1-NFκB通路；(B) C20orf27与PP1c相互作用释放GADD34而激活TGFβR-TAK1-NFκB通路，从而促进CRC肿瘤的生长。
哺乳动物激酶/磷酸酶包括两个成员，一个是蛋白酪氨酸激酶/磷酸酶，另一个是丝氨酸苏氨酸激酶/磷酸酶(PP)。细胞中蛋白的磷酸化和去磷酸化状态受蛋白质激酶和磷酸酶的相反作用调节。1型磷酸酶(PP1)的催化亚基PP1c通过其调节亚基GADD34被募集到TGFβR1-Smad7-GADD34复合物中，从而使TGFβR1去磷酸化。PP1全酶促进TGFβR去磷酸化，形成了TGF信号通路的负反馈调节。TGFβR1的去磷酸化是TGF通路传导中一个有效控制负反馈的机制。TGFβ通过招募TGFβR1-Smad7-GADD34复合物中PP1c而抑制TAK1磷酸化，从而抑制IKK 和IκB的磷酸化，进一步抑制NFκB的核易位。
NFκB转录因子是许多细胞过程的关键调节因子，包括细胞免疫、细胞增殖和凋亡、细胞炎症和细胞的急性期反应。在恶性肿瘤的发生发展过程中，能够控制细胞生长和增殖的信号通路至关重要。在大多数正常细胞中，这些NFκB二聚体直接与IκB抑制剂结合，并作为一种不活跃的复合物留在细胞质中。许多信号通路可能导致IκB蛋白的降解并激活NFκB复合物，从而转移到细胞核中。NFκB通过cyclinD1调控细胞周期，通过Bcl-2和caspase3调控细胞凋亡，从而影响肿瘤细胞的存活和增殖。研究揭示C20orf27调控CRC细胞中TGFβR-TAK1-NFκB通路。C20orf27与PP1c的相互作用影响PP1对此通路的去磷酸化抑制作用，从而激活NFκB以及调节细胞周期和细胞凋亡。当前数据清楚地表明C20orf27通过调节TGFβR-TAK1-NFκB通路促进CRC细胞生长和增殖。
另外，根据奥沙利铂治疗的结果(图3)，C20orf27可能与耐药性有关，可以考虑作为预后的标志物进一步探索。这将是我们下次研究的重点。