科研| Ann Rheum Dis：血清代谢组和脂质组差异确定血清阴性类风湿性关节炎和银屑病关节炎的潜在生物标志物

编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

目的：血清阴性类风湿性关节炎(negRA)和银屑病关节炎(PsA)的鉴别诊断往往比较困难，因为它们症状相似，且缺乏可靠的临床标志物。由于慢性炎症引起了血清代谢组和脂质组的重大变化，于是我们检测血清代谢物和脂质的差异能否有助于提高这些疾病的鉴别诊断。

方法：收集确诊的negRA和PsA患者血清，建立生物标志物探索数据集和盲法检验数据集。样品经质子核磁共振分析，根据光谱计算代谢物浓度，用于选择变量，建立多元诊断模型。

结果：单变量分析显示氨基酸的血清浓度存在差异：丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸；有机化合物的血清浓度存在差异：醋酸、肌酸、乳酸和胆碱；L3/L1、L5/L1和L6/L1的脂质比率存在差异，但曲线下面积(AUC)值低于70%，表明特异性和敏感性较差。多元诊断模型包括年龄，性别，丙氨酸、琥珀酸、磷酸肌酸的浓度及L2/L1、L5/L1、L6/L1的脂质比值，它提高了诊断的敏感性和特异性，AUC为84.5%。使用该生物标志物模型，盲法检验的71%患者被正确分类。

结论：PsA和negRA具有独特的血清代谢组学和脂质组学特征，可作为区分二者的生物标志物。在更大的多种族群体中进行验证后，该诊断模型可能成为明确诊断negRA或PsA患者的有价值的工具。

论文ID

原名：Differences in the serum metabolome and lipidome identify potential biomarkers for seronegative rheumatoid arthritis versus psoriatic arthritis

译名：血清代谢组和脂质组差异确定血清阴性类风湿性关节炎和银屑病关节炎的潜在生物标志物

期刊：Annals of the Rheumatic Diseases

IF：14.299

发表时间：2020.4

通讯作者：Margarida Souto-Carneiro

通讯作者单位：海德堡大学附属医院

实验设计

实验结果

1. 来自negRA和PsA患者的血液样本的代谢组学和脂质组学特征

在单脉冲¹H-NMR图谱中，可以观察到小分子和大分子的峰，导致不同的化合物造成不均匀的基线和重叠的信号。尽管如此，由于它们的光谱特征，使用¹H-NMR也有可能识别和量化血清中的脂质(图1A)。通过抑制来自脂质和蛋白质的信号，Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)脉冲序列使得低分子量化合物的峰不被大分子产生的信号所掩盖。由于它们的特征是具有清晰的信号和明确的基线，所以CPMG NMR可以更好地识别和分析小分子产生的信号(图1B)。

2. 非靶向分析

对¹H单脉冲和CPMG NMR谱进行多元统计分析，以确定这两种疾病之间是否存在特征性的光谱模式或峰。在此基础上进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和随机森林模型，没有证据表明任何临床和人口统计学的协变量可以影响患者的血清代谢组学模式。此外，临床或人口统计学的协变量与¹H和CPMG光谱区域之间没有显著的相关性(图1C)。临床和人口统计学特征总结在表1中。

图1 PsA和negRA患者有不同的光谱特征，与临床和人口统计学的协变量无关。

表1 研究参与者的临床和人口统计学数据

由于主成分分析的代谢组学数据聚类比较困难，所以采用PLS-DA对¹H和CPMG光谱数据集进行评价。尽管主成分1-5解释了¹H数据中96.9%的差异，或CPMG数据中84.6%的差异，但没有明显的聚类以区分negRA和PsA患者(图2A)。在评价PLS-DA模型的质量时，其精度≤65%，R²和Q²值都很低(¹H-spectra: R²=0.13, Q²=0.06; CPMG spectra: R²=0.16, Q²=0.08)。为了提高基于光谱模式的诊断准确性，我们使用了随机森林分类算法，因为它对高维数据分析具有鲁棒性。在¹H和CPMG光谱中，该算法识别出相似的区域以区分negRA和PsA患者，根据¹H对negRA和PsA患者进行分类，¹H分类的误差为0.361，CPMG为0.336(图2B, C)。然而，随机森林算法可以识别重要的光谱区域而用于聚焦目标分析。

图2 通过监督型PLS-DA分析和随机森林分析，从negRA和PsA患者的血清样本¹H和CPMG NMR谱中获得了图谱。

3. 靶向分析

对于脂质组学分析，采用单脉冲¹H-NMR图谱。由于脂质信号的广泛性，我们对7组脂质信号(L1-L7)进行了评估，并将其指定为如下脂质信号：L1：脂质甲基；L2：脂质脂肪链；L3：脂质β-亚甲基；L4：脂质烯丙基亚甲基；L5：脂质α-亚甲基；L6：脂质多不饱和烯丙基亚甲基；L7：脂质烯烃(图1A)。由于脂质信号的广泛性，比较患者的脂质组与脂质甲基组L1的比值。在CPMG光谱的代谢组学分析中，我们选择了24种可以被明确识别和量化的代谢物，它们存在于健康的人类血清中，并已被报道在慢性关节炎中发生改变(图1B)。

在量化代谢物和脂质组的浓度后，通过单变量分析确定患者组之间的差异。24种代谢物中，9种在两组之间存在显著差异，即氨基酸(AA)丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸，以及有机化合物乙酸、胆碱、肌酸和乳酸。在我们的分析中，negRA和PsA患者间L3/ L1、L5/L1和L6/L1脂质比率存在统计学差异(图3A)。并且比较两组时，某些代谢途径明显富集(图3B)。

4. 血清代谢物和血脂与患者临床数据的相关性

年龄、性别和治疗方案会影响不同疾病中生物体液中代谢物的浓度，从而影响初始治疗患者或不同年龄患者使用的生物标志物的确认。为了分析任何临床或人口统计学参数是否会影响24种代谢物或脂质组的血清浓度，我们对相关代谢物和潜在的临床和人口统计学混杂因素进行了单因素和多因素的多变量分析(MANOVA)。疾病活动与胆碱浓度、L2/L1和L7/L1变化有关，而病程则与柠檬酸、磷酸肌酸、葡萄糖、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸的浓度变化有关。年龄和体重指数与疾病组相结合时，代谢物浓度和脂质比值的变化也同样明显。虽然RA主要影响女性，与PsA不同，但疾病联合性别的单因素方差分析在相关代谢物方面没有任何显著差异。当疾病和治疗相结合时也是如此。单变量分析未发现代谢物浓度或脂质比率与临床和人口统计学变量之间存在任何显著的相关性(图3C)。

5. 患者分类的多变量诊断模型

对受试者进行单个代谢物或脂质比值的ROC分析，得出曲线下面积(AUC)低于70%。因此，单变量模型没有足够的敏感性和特异性来区分PsA和negRA患者。为了达到最高的诊断准确性，我们构建了三种不同的机器学习算法：随机森林、朴素贝叶斯法和多元逻辑回归，分别对73例PsA和49例negRA患者的代谢组学和脂质组学特征进行分析。随机森林预测患者PsA的准确率为73.3%，朴素贝叶斯法预测患者PsA的准确率为63.7%。

通过逐步向前-向后选择算法，将以下诊断的预测因子纳入诊断模型：年龄，性别，L6/L1, L5/L1, L2/L1，丙氨酸，琥珀酸和磷酸肌酸。

在首次验证过程中，使用10倍的交叉验证(CV)对得到的模型进行评估，得到了表2中的系数估值。

表2 模型系数的估值

将这些估计值运用到回归模型中，得到以下公式:

将各代谢物的浓度、年龄和性别(男=1，女=0)代入F1公式。将F1得到的结果代入F2公式中，计算属于PsA组的概率。

将F2得到的结果代入F3公式中，计算属于negRA组的概率。

为了将患者分为两组，必须选择计算的概率(F2)作为区分值。通常，如果一个受试者的PsA估值大于0.5，则应用0.5作为区分值，并将其归类为PsA，这反映出一个受试者的归类是其更有可能被诊断的疾病类型。ROC曲线显示了该模型对这个区分值和整个区域的敏感性和特异性，ROC曲线(AUC)为84.5%(图3D)。

为了进一步验证从交叉验证过程中获得的模型，我们收集了35名新关节炎患者的独立样本。该数据集与用于建立诊断模型的数据集有相似的路径分布(图3E)。使用区分值0.5对数据集进行评估，得到62.9%患者的正确预测(表3)，并进行ROC分析，其中AUC下降到71.6%(图3F)。

诊断预测后，对13例患者重新进行了临床评估，其预测诊断结果与风湿病学家最初做出的诊断结果不同。其中4名患者仍然不能确诊，因为他们一直缺乏独特的临床参数。考虑到这一点，我们将这4个患者从验证数据集中剔除，重新计算预测率，结果预测率增加到71.0%，并进行新的ROC分析，结果增加了敏感性(62.5%)和特异性(80.0%) (图3G)。

表3 盲法检验数据集的分类表

图3 几种代谢物和脂类的浓度可以区分negRA和PsA患者。

结论

基于¹H-NMR的代谢组学作为非自身免疫性疾病临床常规诊断工具的成功实施，我们的研究为该技术作为自身免疫性疾病的常规诊断技术奠定了基础。此外，我们的数据强调，即使在临床特征相似的情况下，不同疾病之间与风湿性关节炎相关的代谢组学过程也是不同的。因此，代谢组学和脂质组学开始为自身免疫研究提供一个全新的领域。

原文网址：https://ard.bmj.com/content/79/4/499.long