科研 | 中国药科大学：蛋白质组学分析显示人参皂苷Rb1通过抑制线粒体复合体I产生的ROS减轻心肌缺血/再灌注损伤（国人佳作）
编译：微科盟彭翰林，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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线粒体复合体I产生的活性氧（ROS）被认为是缺血/再灌注（I/R）损伤的重要原因。人参皂苷Rb1对心肌缺血再灌注损伤有保护作用，但其机制尚不清楚。本研究旨在探讨人参皂苷Rb1是否通过抑制线粒体复合体I产生ROS来减轻心肌I/R损伤。本研究采用的方法如下：在体内实验中，给予小鼠人参皂苷Rb1，然后进行I/R损伤，用线粒体靶向探针MitoB测定心脏线粒体ROS水平，并用基于TMT的定量蛋白质组学分析线粒体蛋白质。在体外实验中，成年小鼠心肌细胞用人参皂甙Rb1预处理，然后进行缺氧复氧损伤，再分析线粒体ROS、NADH脱氢酶活性和线粒体复合体I的构象变化。实验结果发现人参皂甙Rb1减少线粒体ROS生成，缩小心肌梗死范围，保护心功能，限制心肌纤维化。蛋白质组学分析表明，线粒体复合体I中的NADH脱氢酶亚基可能是人参皂苷Rb1调节的效应蛋白，因此可以得到结论，抑制线粒体复合体I介导的ROS爆发可能是人参皂甙Rb1减轻心肌I/R损伤的机制。
论文ID
实验设计
实验结果
1.人参皂苷Rb1减少再灌注后琥珀酸酯驱动的ROS产生
线粒体ROS在原代成年小鼠心肌细胞中受到I/R损伤后迅速增加，但通过人参皂苷Rb1预处理而被阻止（图1A）。因为积累的琥珀酸酯是再灌注后线粒体ROS产生的驱动力，所以我们用细胞渗透性琥珀酸二甲酯处理了心肌细胞，并通过寡霉素抑制ATP合酶来模仿RET介导的ROS产生。由于抑制ATP合酶引起了高Δψm，琥珀酸诱导了ROS的增加，而人参皂苷Rb1的预处理降低了琥珀酸诱导的ROS释放（图1B）。为了证实其在体内的作用，我们使用了线粒体靶向的ROS探针MitoB来量化遭受I/R损伤的小鼠心脏中ROS的产生。结果表明，人参皂苷Rb1的给药在再灌注阶段早期有效地阻断了线粒体ROS的产生（图1C），并且人参皂苷Rb1减弱了DNA的氧化损伤（图1D）。此外，我们观察到，再灌注前人参皂苷Rb1的使用在I/R手术后的第14天显著降低了ROS的水平，这种作用甚至在第28天仍然存在（图1E-F）。
图1 人参皂苷Rb1减少了再灌注时琥珀酸酯驱动的ROS的产生
A.用线粒体超氧化物歧化酶(MitoSOX Red)超氧化物指示剂检测缺氧/复氧处理的成人原代心肌细胞的ROS生成。B.用琥珀酸二甲酯(Suc)和寡霉素(Olego)处理原代心肌细胞2h后ROS的生成。C.观察人参皂甙Rb1对再灌注15min后心肌细胞ROS生成的抑制作用。D.缺血30min再灌注15min小鼠心脏8-羟基鸟苷(8-OHG)免疫组织化学染色。人参皂苷Rb1预处理对再灌注后第14天(E)或28天(F)心脏ROS水平的影响。
2. 人参皂苷Rb1引起的ROS减少可保护心肌细胞免受急性I/R损伤
I/R损伤线粒体功能，如引起原代心肌细胞中MPTP的打开和Δψm的改变（图2A-B），人参皂苷Rb1预处理可防止这些改变，并且人参皂苷Rb1相应地减少了细胞死亡（图2C）；同样，人参皂苷Rb1在I/R损伤有效减少了心肌细胞凋亡（图2D）。人参皂苷Rb1在缺血前和再灌注开始时均显著减少了梗塞面积（图2E）。但是，再灌注后15分钟给药时我们未观察到这种保护作用（图2E），这表明及时干预对心脏保护至关重要。
图2 人参皂苷Rb1引起的ROS减少可保护心肌细胞免受急性I/R损伤
A-C，成年原代心肌细胞用人参皂甙Rb1(10µM)处理，低氧(1%O2)1h后复氧1h(H/R)。测定线粒体通透性转换孔(A)、4个独立实验的代表性图像和线粒体电位定量(Δψm) (B)，以及细胞存活率(C)。D.缺血30min再灌注24h小鼠心脏典型图像及TUNEL染色。E，心肌缺血再灌注损伤小鼠，在缺血前、再灌注开始时和再灌注15min后给予人参皂甙Rb1TTC染色的代表性照片。
3. 再灌注前人参皂苷Rb1的给药有助于改善恢复过程中的心脏功能
再灌注期间ROS的产生是心脏功能受损，预后不良的原因。我们观察到，在缺血之前人参皂苷Rb1的给药可维持心脏功能，并防止I/R损伤后2周的小鼠线粒体肿胀（图3A-B）。心脏基因谱分析的相应结果表明，与心肌纤维化相关的几种生物学途径均受到影响。这些基因集与TGF-β信号通路和ECM-受体相互作用有关，在再灌注前人参皂苷Rb1逆转它们的上调（图3C）。随着心脏损伤的进展，缺血前人参皂苷Rb1的给药可在I/R损伤后28天中保持小鼠心脏功能并减轻心脏纤维化（图3D）。这些结果表明，再灌注前给予人参皂苷Rb1不仅减少了急性心肌细胞的损害，而且在恢复过程中也有助于改善心脏功能。
图3 再灌注前人参皂苷Rb1的给药有助于恢复过程中心脏功能的改善
A.I/R损伤后14d心功能测定。B.I/R损伤后14d测定心肌线粒体结构。C.I/R损伤后14天测量心脏基因图谱。D.小鼠心肌缺血再灌注28d后心脏立体、典型图像及Masson's三色染色定量。
4.蛋白质组学揭示人参皂苷Rb1调节线粒体复合体I
因为线粒体ROS引起再灌注损伤，所以我们从接受I/R损伤的小鼠心脏中纯化了线粒体，以进行基于TMT的定量蛋白质组分析。在不存在其他蛋白质的情况下，线粒体蛋白质中禁止素的相对强度显着增加，表明其高纯度和富集（图4A）。有17262个肽被映射到3054个蛋白质中（图4B），以p值<0.05为标准，我们发现591个显著变化的蛋白质。与对照组相比，I/R组的186个蛋白表达升高，而405个蛋白表达降低（图4B）。PCA分析表明，I/R组与对照组明显分离，人参皂苷Rb1处理可部分逆转蛋白质模式（图4C）。
接下来，根据它们的变化趋势，我们将这些差异蛋白分为4个簇（图4D）。在I/R组中，簇1中的蛋白质高度增加，但在人参皂苷Rb1处理组中明显减少。I/R组簇2中的蛋白质表达减少，而人参皂苷Rb1处理组中的蛋白质表达增加；人参皂苷Rb1处理对簇3和4中的蛋白质没有影响，这些结果表明，簇1和2中的蛋白质被人参皂苷Rb1调节。对簇1和2的GO分析表明，这些蛋白质的分子功能与氧化还原酶和NADH脱氢酶活性密切相关（图4E）。有趣的是，蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，这些蛋白质彼此相互作用，并与氧化磷酸化和核糖体功能有关（图4F）。具体而言，线粒体复合体I蛋白在心肌损伤中上调，但被人参皂苷Rb1挽救到正常水平（图4F）。表1列出了在再灌注早期人参皂苷Rb1对线粒体复合体I蛋白的调节作用，其中，通过人参皂苷Rb1处理可显著拯救位于NADH脱氢酶（N模块）亚单位中的蛋白质，例如Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6和Ndufa12（图4G，表1）。综上所述，这些结果表明人参皂苷Rb1可能通过调节线粒体复合体I中的蛋白质来保护心脏免受I/R损伤。
图4 蛋白质组学揭示人参皂苷Rb1调节线粒体复合体I
C57BL/6J小鼠腹腔注射人参皂苷Rb1(50mg/kg)，心肌缺血30min，再灌注15min。提取心肌组织线粒体蛋白进行蛋白质组学分析。A.Western blot检测从心脏组织中提取的浓缩线粒体片段的纯度。B.缺血/再灌注(I/R)组和假手术组比较，蛋白质有明显变化。C.假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)和I/R+人参皂苷Rb1治疗组(I/R+Rb1)的主成分分析(PCA)。D.根据假手术组、I/R组和I/R+Rb1组的变化趋势对差异显著的蛋白质进行聚类分析。每条折叠线代表一种蛋白质的变化趋势。定位于簇1和簇2的蛋白质被认为是被人参皂苷Rb1拯救或调节的。E.使用基因本体论(GO)数据库对人参皂苷Rb1拯救或调节的蛋白质进行功能分类。利用string数据库对人参皂苷Rb1挽救或调节的蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。红色和蓝色表示人参皂苷Rb1拯救或调节蛋白质的程度。G.人参皂苷Rb1处理挽救或调节的线粒体复合体I中定位蛋白的分布示意图。
表1 人参皂苷Rb1对再灌注早期线粒体复合体I蛋白的调节
5.人参皂苷Rb1选择性抑制线粒体复合体I的活性，但不抑制复合体II和IV的活性
接下来，我们检查了人参皂苷Rb1是否调节线粒体电子转移链功能。尽管对基础OCR没有显着影响，但人参皂苷Rb1显著抑制了最大呼吸，而不会影响对抗霉素A不敏感的非线粒体O2的消耗（图5A）。当丙酮酸和苹果酸用作底物时，人参皂苷Rb1处理抑制了心肌细胞中复合体I依赖性O2消耗（图5B）；同样，人参皂苷Rb1在分离的线粒体中抑制线粒体复合体I的活性（图5C）。不同的是，鱼藤酮不可逆地抑制线粒体复合体I活性，而洗脱掉人参皂苷Rb1之后，线粒体复合体I的活性可以恢复（图5D）。该结果表明人参皂苷Rb1的抑制作用是可逆的。当我们将琥珀酸酯用作复合体II激活的底物时，人参皂苷Rb1不会改变完整心肌细胞中的O2消耗，并且它也不能抑制分离的线粒体中的线粒体复合体II活性（图5E）；同样，人参皂苷Rb1对线粒体复合体IV依赖的呼吸作用和复合体IV活性也没有影响（图5F）。综上所述，这些结果表明人参皂苷Rb1以可逆的方式特异性抑制线粒体复合体I的活性。
图5 人参皂苷Rb1选择性抑制线粒体复合体I的活性，但不抑制复合体II和IV的活性A.H9c2细胞在人参皂苷Rb1(10µM)、FCCP(2.5µM)、丙酮酸(PYR，10mM)和抗霉素A(AA，1µM)存在下的耗氧率(OCR，%基线)。B.用洋地黄(3µg/mL)渗透H9c2细胞，然后用ADP(1 MM)、丙酮酸(5 MM)、苹果酸(5 MM)和Rb1(10µM)刺激H9c2细胞。C.人参皂苷Rb1(10µM)或鱼藤酮(1µM)对H9c2细胞线粒体复合体I活性的影响。D.OCR检测ADP(1 MM)、谷氨酸(5 MM)+苹果酸(5 MM)和琥珀酸(5 MM)对H9c2细胞通透性的影响。在此，H9c2细胞在OCR测量前用人参皂苷Rb1(10µM)或鱼藤酮(1µM)预处理1h。E.在琥珀酸(5 MM)、鱼藤酮(0.5µM)和人参皂苷Rb1(10µM)存在下，通透性H9c2细胞的E、OCR(%基线)。F.注射FCCP(2.5µM)、TMPO(0.4mM)+抗坏血酸(0.4 mM)、人参皂苷Rb1(10µM)和叠氮(5 MM)的H9c2细胞的OCR(%基线)。
6. 人参皂苷Rb1可逆地抑制线粒体复合体I的NADH脱氢酶
复合体I的NADH脱氢酶是产生ROS的候选位点。由于蛋白质组学结果表明，属于NADH脱氢酶亚基的差异蛋白的水平随I/R损伤而改变，因此我们检查了这些蛋白的基因和蛋白表达。I/R处理上调了心肌细胞中Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4和Ndufa12的mRNA表达，但人参皂苷Rb1预处理降低了这些增加的基因表达（图6A）。在I/R条件下，NADH脱氢酶这些亚基的基因敲低减少了ROS的产生并保护了细胞的活力（图6B-C）。人参皂苷Rb1在基础和I/R条件下均降低了心肌细胞线粒体复合体I的NADH脱氢酶活性（图6D-E）。线粒体复合体I抑制剂鱼藤酮不能抑制NADH脱氢酶，因为它与泛醌结合，而不是NADH脱氢酶。人参皂苷Rb1的洗脱恢复了NADH脱氢酶的活性，表明人参皂苷Rb1对复合体I的抑制作用是可逆的（图6F）。为了确认人参皂苷Rb1调控NADH脱氢酶的特殊作用，我们将编码酿酒酵母内部NADH脱氢酶的基因转染到了H9c2细胞中。Ndi1是单个多肽，可作为哺乳动物线粒体呼吸链中复合体I的替代分子。人参皂苷Rb1无法降低Ndi1表达细胞中的OCR（图6G）；同样，表达Ndi1的细胞对人参皂苷Rb1在I/R刺激下对ROS产生的抑制作用具有抗性（图6H），而Ndi1的表达加重了RET介导的ROS产生，并逆转了人参皂苷Rb1的抑制作用（图6I）。这些结果表明人参皂苷Rb1的心脏保护作用可能是由于其抑制了线粒体复合体I中的NADH脱氢酶活性。
图6 人参皂苷Rb1可逆地抑制线粒体复合体I的NADH脱氢酶
A.缺氧再灌注心肌细胞Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12的mRNA表达。转染Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12 siRNA的H9c2细胞的B-C、ROS水平(B)和细胞存活率(C)。D.人参皂苷Rb1或鱼藤酮对成人原代心肌细胞NADH脱氢酶活性的影响。E.成年原代心肌细胞缺氧(1h)再灌注15min后NADH脱氢酶活性。F.成年原代心肌细胞用人参皂苷Rb1(10µM)预处理1h，然后将人参皂苷Rb1留在原代心肌细胞上进行进一步测定，或将人参皂苷Rb1洗掉，继续培养1h，测定NADH脱氢酶活性。G.Ndi1蛋白在转染Ndi1质粒的H9c2细胞中的表达。在人参皂苷Rb1(10µM)、FCCP(2.5µM)、丙酮酸(PYR，10 mM)和抗霉素A(AA，1µM)存在下，Ndi1表达细胞的耗氧率(OCR，%基线)。H.Ndi1蛋白表达。缺氧/再灌注损伤时表达Ndi1的细胞内ROS水平的变化。I. Ndi1蛋白表达。琥珀酸二甲酯和寡霉素作用于表达Ndi1细胞2h后产生的ROS。
7.人参皂苷Rb1控制线粒体复合体I的活性/去活性转变，以调节NADH脱氢酶活性
在I/R损伤中，线粒体复合体I的活性/失活转变与ROS的产生高度相关，呼吸系统复合体I的失活形式被认为是Na+/H+反向转运蛋白。因此，我们在H9c2细胞中测量了线粒体基质的pH（图7A）。在缺血状态下，线粒体内pH较低，但对再灌注响应升高（图7A）。人参皂苷Rb1处理在再灌注后可使线粒体内pH保持在较低水平，这表明人参皂苷Rb1使线粒体复合体I保持失活状态（图7A）。响应缺血或温度处理而发生的构象变化导致线粒体亚基ND3内关键Cys-39的暴露，可以用巯基特异性试剂标记线粒体复合体I的失活（图7B）；此外，人参皂苷Rb1在再灌注中保护了ND3在小鼠心脏中的暴露，进一步证实了人参皂苷Rb1对体内线粒体复合体I状态的影响（图7C）。为了揭示潜在的机制，我们进行了分子对接，以测试人参皂苷Rb1与复合体I中参与活性/失活转变的亚基（ND3，ND1和Ndufa9）之间的潜在相互作用，发现人参皂苷Rb1与Cys-39，Tyr-37和Asp-42的ND3氨基酸残基相互作用（图7D）。为了确认人参皂苷Rb1是否直接靶向ND3，我们进行了表面等离子体共振技术，结果表明人参皂苷Rb1对ND3表现出很强的结合亲和力（图7E）。这些结果表明人参皂苷Rb1可能通过与复合体I中的ND3亚基结合而使酶陷入失活构象。失活状态的特征是与活性构象相比，NADH脱氢酶活性较低。通过限制处于失活状态的线粒体复合体I，人参皂苷Rb1处理在再灌注或再激活阶段具有较低的NADH脱氢酶活性（图7F）。
图7 人参皂苷Rb1控制线粒体复合体I的活性/去活性转变，以调节NADH脱氢酶活性
A.有丝分裂细胞线粒体定位的代表性图像。稳定转染MITO-Sypher的H9c2细胞。B.线粒体复合体的BODIPY-TMR标记示意图。C.I/R损伤时小鼠心脏线粒体蛋白的BODIPY-TMR信号(左)。D. AutoDock预测人参皂苷Rb1与参与活性/失活转换的线粒体复合物I亚基(ND3、ND1和NDUfa9)之间的结合模式。E.人参皂苷Rb1与人重组ND3蛋白结合的SPR分析。F.人参皂苷Rb1(10µM)处理H9c2细胞，缺氧1h，复氧和不复氧15min下的线粒体复合物I活性。
讨论
再灌注后，琥珀酸脱氢酶激活会由于RET而驱动复合体I上ROS生成，而通过抑制复合体I可以抑制以这种方式生成ROS。鱼藤酮通过调节泛醌以减弱电子通量来抑制复合体I活性；另外，线粒体复合体I在特定部位的S-亚硝化可限制再灌注时ROS的产生。在本篇文章中，我们确定了线粒体复合体I中的NADH脱氢酶亚基蛋白是人参皂苷Rb1调控的潜在靶标。由于线粒体ROS的产生是再灌注损伤的最初原因，人参皂苷Rb1抑制NADH脱氢酶的活性，从而阻止了ROS的产生，表明其在心脏保护中的特殊作用。
在处理急性心肌缺血中，及时进行再灌注对于挽救心肌至关重要；但是，这种干预受到了再灌注损伤的挑战。据报道，致命的心肌再灌注损伤可能占最终梗死面积的50％，尽管涉及许多病理生理因素，但线粒体ROS的产生已成为导致I/R引起组织损伤的一系列事件的最初原因。人参皂苷Rb1已被证明可以保护心脏免受I/R损伤，我们进一步证实，这种心脏保护作用很大程度上取决于再灌注后对ROS的抑制作用。在缺血性心脏中，在再灌注的早期会迅速产生过量的ROS，而在I/R损伤之前给予人参皂苷Rb1可以减少ROS的产生并防止心脏中的DNA氧化损伤。由于缺血的预防性治疗在临床上不可行，因此我们在再灌注开始时研究了人参皂苷Rb1的治疗方法并确认了其保护作用。但是，再灌注后15分钟给药无法保护心脏。重要的是，再灌注前人参皂苷Rb1的治疗可提供长期的心脏保护作用。因为在再灌注的前10–20分钟内过量的ROS产生对于急性和长期心脏损害都是至关重要的，所以我们认为在再灌注早期抑制ROS产生是人参皂苷Rb1主要的保护机制。
线粒体ROS通常被认为是ETC损坏引起的，因为增加的电子泄漏会在复合体I和III上产生超氧化物。抑制复合体I会阻止电子沿着ETC流动，从而导致ROS的产生增加。当电子无法转移到CoQ时，高度还原的FMN驱动电子泄漏以生成ROS；然而，最近的一项研究表明，线粒体复合体I的抑制在再灌注的早期阶段有助于减弱RET介导的ROS爆发。再灌注后，线粒体复合体II的琥珀酸氧化生成大量电子提供燃料，从而导致最大Δψm并大大降低了CoQ池。然后，高膜电位迫使电子从CoQ池向复合体I中的FMN流动，从而产生ROS。在本研究中，我们发现人参皂苷Rb1调节线粒体ETC功能。研究者们已经使用了许多蛋白质组学和代谢组学等组学技术来确定缺血性心脏病的潜在治疗靶点，在本研究中，蛋白质组学结果表明人参皂苷Rb1可能通过调节复合体I活性来保护心脏免受I/R损伤。总之，这些数据表明人参皂苷Rb1通过调节复合体I活性阻止了RET介导的ROS产生。
复合体I是NADH：泛醌氧化还原酶，它利用NADH氧化和泛醌还原作用生成ATP。哺乳动物复合体I包含三个结构模块：N，Q和P。其中，N-模块（脱氢酶模块）包含Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6等。通过比较蛋白质组学分析，我们发现当心脏受到I/R损伤时，线粒体复合体I中的NADH脱氢酶亚基为人参皂苷Rb1调节的潜在效应蛋白。与已发表的研究表明这些亚基的化学修饰或遗传损失可以保护心脏免受缺血性应激的影响一致，我们证明了这些亚基的敲除减少了ROS的产生并保护了心肌细胞。为了进一步证实人参皂苷Rb1在抑制NADH脱氢酶中的特殊作用，我们在心肌细胞中过表达Ndi1，其中，Ndi1是编码酿酒酵母线粒体对鱼藤酮不敏感的内部NADH-醌氧化还原酶的基因，可以将其转染到哺乳动物细胞的线粒体中，作为复合体I的替代分子，将电子从NADH转移到泛醌库中。人参皂苷Rb1不能抑制表达Ndi1的细胞中的复合体I活性和减少ROS的产生，支持了我们的推测，即它通过抑制NADH脱氢酶防止了再灌注时ROS的爆发。我们的工作进一步表明，NADH脱氢酶是一种潜在的效应子，可以通过调节其来防止RET驱动的ROS的产生。
在长时间的局部缺血中，由于氧气有限，复合体I转变为失活状态。与活性形式相比，复合体I的失活构象表现出较低的催化活性，失去了催化RET的能力。再灌注后，复合体I迅速重新活化以进行电子转移，从而导致过多的ROS生成。从理论上讲，以失活形式暂时锁定复合体I可作为一种保护机制，以限制ROS的产生。为支持该理论，有人提出利用二甲双胍使复合体I处于失活状态来保护心脏免遭缺血性损伤。位于ND3亚基亲水环中的Cys-39的暴露是复合体I失活形式的分子特征。Cys-39的可逆翻译后修饰是一种治疗性干预措施，用于以失活形式捕获复合体I。在本研究中，人参皂苷Rb1在再灌注的早期阶段持续暴露了被硫醇特异性试剂标记的ND3亚基，表明其将复合体I锁定在低活性状态的潜在能力。进一步的分子对接分析表明，人参皂苷Rb1通过在三个氨基酸残基（包括Cys-39）处的氢键与ND3的亲水环相互作用。SPR分析进一步表明人参皂苷Rb1可以高亲和力结合ND3亚基。这些结果表明人参皂苷Rb1可能通过结合ND3亚基而以其失活构象捕获线粒体复合体I，但是，需要进一步研究来阐明人参皂苷Rb1作用于线粒体复合体I的具体分子机制。不过，我们的结果表明人参皂苷Rb1作用于NADH脱氢酶活性的潜在机制可能源于其对活性/去活性的调控。
哺乳动物成年心肌细胞是终末分化的，因此，成年心脏在心肌细胞丧失后不能再生，这主要是由于出生后心肌细胞周期停滞所致。因此，在人参皂甙Rb1治疗的小鼠脑缺血后，我们观察到的梗死面积缩小应该是其对再灌注损伤的最初保护作用的持久结果。心肌梗死后，重构过程最初作为一种代偿调节对心脏起到保护作用；然而，由于心肌僵硬，不受控制的纤维化反应会损害心脏功能。由于梗死心脏是纤维化的，我们检测了人参皂苷Rb1在缺血后的长期效应，并证实了它对心肌纤维化的抑制作用。这表明，限制再灌注损伤对于恢复期的功能改善很重要，但需要注意的是，恢复期观察到的心功能改善是多方面调节的最终结果。考虑线粒体功能的全面研究对于全面评估潜在的影响是必要的，因此，我们不能肯定地说，对抗再灌注损伤是观察到的心功能改善的唯一原因。虽然缺血只提供了一个狭窄的时间窗口来减少心脏损害，但我们的工作强调了及时的治疗干预对于改善预后至关重要。
总之，人参皂苷Rb1通过降低NADH脱氢酶活性并将线粒体复合体I锁定在失活状态，从而适度和可逆地抑制线粒体复合体I，有助于减轻心肌再灌注损伤。这些发现不仅为人参皂苷Rb1保护心脏免受缺血性损伤的机理提供了新颖的见解，而且还表明，调节复合体I中的NADH脱氢酶活性可能是限制再灌注诱导的线粒体ROS产生的潜在干预措施。