白念珠菌侵袭性感染中分泌的小型蛋白可激发机体TLR2/4介导的炎症反应
导读
白色念珠菌 (C. albicans) 是机体条件致病菌，可由共生菌转变为病原菌，造成黏膜或其他部位产生散播性念珠菌病。宿主依靠病原模式识别受体如Toll样受体（TLRs）和C型lectin受体（CLRs）介导的信号通路唤起机体免疫反应抵抗真菌病原侵袭，产生免疫保护。然而，真菌和先天性免疫之间的复杂互作关系仍有许多未知。本研究发现在低N和大量血清刺激的环境中，C. albicans可上调一种富含半胱氨的低分子分泌蛋白Sel1的表达。Sel1蛋白可激活NF-κB和MAPK信号通路，引起促炎性因子和趋化因子的表达。通过基因和生化系统分析，揭示Sel1的识别，依靠TLR2和 TLR4识别。Sel1缺陷型C. albicans在模型动物血源性感染时，会损害机体免疫反应，升高动物的发病率和死亡率。本研究揭示了白色念珠菌和宿主互作中一个重要因子，为明晰白色念珠菌感染和炎症关系开启新思路。
论文ID
原名：A small secreted protein triggers a TLR2/4-dependent inflammatory response during invasive Candida albicans infection
译名：白念珠菌感染中分泌的小型蛋白可激发机体TLR2/4介导的炎症反应
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
IF：17.872
发表时间：2019.3
通讯作者：Hui Xiao & Jiangye Chen
通讯作者单位：中国科学院上海生化与细胞生物研究所，中国科学院上海巴斯德研究所
DOI：10.1038/s41467-019-08950-3.
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-019-08950-3
实验设计
白色念珠菌C.albicans感染机体简图
C.albicans与机体互作简图如下。菌体进入组织上皮后，在宿主生理条件下（低氨气浓度、血清）进行增殖，产生Sel1蛋白被细胞表面TLR2和TLR4识别，启动病原模式识别信号通路，激活相应的信号因子TAK1，MAPKs，IKKs，启动核转录因子AP-1和NF-κB，诱导促炎因子和细胞因子的过表达，递呈给单核细胞和中性粒细胞，吞噬菌体或使其裂解，清除真菌体。
实验材料
1. 动物：ICR 和 C57BL/6小鼠，免疫缺陷小鼠（Myd88-/-, Trif-/-, Tlr2-/-, Tlr4-/-, Tlr5-/-, Tlr7-/-, Il1r-/-）
2. 细胞：BMDMs-小鼠骨髓来源的巨噬细胞，分离于6–8周龄的C57BL/6小鼠股骨和胫骨。BMDCs-小鼠骨髓来源树突状细胞，分离于6–8周龄的C57BL/6小鼠股骨和胫骨。PBMCs- 人外周血单个核细胞，分离于健康志愿者。细胞系264.7 细胞(ATCC® TIB-71) 和L929 cells (ATCC® CRL-6364) 。
实验方法
白色念珠菌C. albicans：野生型SC5314用于SEL1诱导试验，C. albicans sel/sel 缺失株由融合PCR同源重组构建。
1. SEL1的诱导：将C. albicans SC5314接种于YPD液态培养基中25℃培养过夜，用PBS洗涤2次，按1:100倍稀释，后加入新鲜的YPD液态培养基25℃培养6h，收集真菌细胞，检测SEL1表达。SEL1表达水平按培养过夜的SEL1水平校准。
2. 增长率和真菌-菌丝转变
将C. albicans SC5314接种于YPD液态培养基中25℃培养过夜，后洗涤重悬于相同体积的PBS中，接种至YPD液态培养基中25℃培养，至菌吸光度值OD260达到规定值。菌-菌丝转变：洗涤培养过夜的酵母，接种入含10%血清的YPD培养基中，37℃培养。真菌-菌丝转换hyphae-to-yeast reversion：诱导产生的菌丝转移到新鲜YPD液态培养基中，25℃培养过夜。按规定的时间取出细胞拍照。菌丝状生长：将过夜培养的C. albicans SC5314接种于YPS琼脂培养基中37℃培养4天。C. albicans SC5314感染BMDM细胞时，可用来鉴别菌形态。
3. RNA提取和qRT-PCR分析
提取C. albicans细胞、组织和培养的细胞中RNA，使用TIANscript RT (KR104)试剂盒反转录获得cDNA，SuperReal PreMix Plus (SYBR Green, FP205) ABI 7900HT Fast Real-time PCR System开展Real-time PCR检测分析。
4. 质粒构建
质粒His-Sel1, His-Sel1 CS mutant转入E. coli BL21 (DE3) Codon-Plus 株(Novagen) 后诱导表达。
5. 蛋白纯化
收获Sel1 和Sel1 突变体蛋白后，采用亲和层析技术纯化蛋白，Ni-NTA 柱(Qiagen)，收获的蛋白保存于-80℃。
6. 蛋白印迹和考马斯亮蓝染色
检测所表达的蛋白
7. 免疫共沉淀和pull-down 试验
检测SEL1蛋白与TLR2/TLR4结合被机体识别
8. 细胞刺激
大肠杆菌E. coli 表达获得的SEL1和AldoB 蛋白，感染BMDMs细胞，3h后检测蛋白SEL1和AldoB 刺激BMDMs细胞产生的细胞因子变化。
9. C. Albicans感染巨嗜细胞
C. albicans SC5314感染细胞系264.7或BMDM，分时间点收集真菌，提取
RNA，用qRT-PCR检测。细胞的噬菌作用和杀菌试验：BMDMs细胞接种野生型C. albicans SC250或sel/sel突变体，接种后0.5h，收菌涂布于YPD平板中，接种后6h，12h用于检测长时间的噬菌作用。
10. C. Albicans感染小鼠
将活的C. Albicans细胞静脉注入ICR小鼠（雄性,体重18-21g），C57BL/6 （雌性, 6周龄，体重18-21g），TLR2/TLR4-敲除小鼠（雄性, 6周龄），感染小鼠每天称重，检测体重损失和存活状况。感染5天后，剖检肝、脾和肾，将组织匀浆稀释后涂YPD平板检测真菌形成单位。提取肾组织RNA，分析细胞因子水平。
11. ELISA检测 TNF，IL-6
采集肾脏匀浆上清；通过心脏采集感染5天的小鼠全血，分离血清。采用ELISA检测样品中的TNF，IL-6水平。
实验内容
1. Sel1是C. albicans中富含半胱氨酸大免疫刺激蛋白
植物和真菌互作中牵涉到多种富含半胱氨酸的分泌型蛋白（SCP），在真菌感染人上尚未报道。本研究以感染人体最盛行的病原菌C. albicans为例，配合其他候选真菌，揭示其对人体免疫反应调节的潜在机理。
通过鉴定C. albicans基因组中27个编码含半胱氨酸蛋白的基因 (Fig. 1a)，皆可编码小分子蛋白（<300个氨基酸），蛋白含有信号肽，且至少含4个半胱氨酸。排除编码蛋白中含跨膜区域或糖基磷脂酰肌醇位点的基因，这类蛋白通常与细胞膜或细胞壁蛋白相关 (Fig. 1a) 。
检测C. albicans在感染时，SCP编码基因的表达形式，特别是面对免疫细胞时。C. albicans在感染巨嗜细胞RAW 264.7 系时，27个SCP编码基因中有超过11个表达水平上调，以基因SCP6为最 (Fig. 1b) 。同时，C. albicans在感染鼠骨髓源巨嗜细胞（BMDMs），基因SCP6表达水平上调最高 (Fig. 1c, Supplementary Figure 1a)。可在C. albicans感染BMDMs的细胞培养液中检测出血凝素标记的Scp6蛋白。去除C. albicans真菌体和巨噬细胞后，在培养基中检测出血凝素标记的Scp6蛋白，说明C. albicans表达Scp6，后分泌至BMDM培养基中 (Fig. 1c)，证实了C. albicans在感染巨噬细胞时诱导表达Scp6蛋白。SCP6基因 (COI1, ORF19.5063) 编码191个氨基酸组成的小分子蛋白，含7个半胱氨酸残基，N末端有1个信号肽 (Fig. 1d)。Orf19.5063原先被命名为Coi1(Ciclopirox Olamine Induced)，最新研究发现其生理功能将在下面详细列出，我们将Orf19.5063重新命名为SEL1。
Fig 1 a-d 相关SCP基因和蛋白
不仅在C. albicans感染BMDMs的培养基中，在RPMI-1640 含10%的胎牛血清培养基中都发现SEL1表达 (Fig. 1e, f)，说明培养基和生长条件对SEL1诱导表达的重要作用。研究结果表明培养基中的氮含量及血清协同作用有利于Sel1的表达和分泌 (Fig. 1g, h)。
Fig 1 e-h 在不同营养培养基中Sel1 蛋白表达的影响
使用工程菌表达出His标记的Sel1蛋白，后纯化。Sel1蛋白刺激可诱导BMDMs产生剧烈促炎反应 (Fig. 2a, b)，qRT-PCR检测表明：促炎性基因Tnf, IL1β, IL6, Cxcl1, Cxcl2, IL12a, IL12b, Cxcl10, IFNβ和 iNos RNA水平升高；ELISA检测表明：BMDMs分泌产生TNF, IL-1β和 IL-6大量增多 (Fig. 2b)。而对照组中His标记AldoB蛋白，不引起BMDMs炎症反应，从而支撑了Sel1的特殊功能。进而，Sel1蛋白可刺激骨髓源树状突细胞（BMDCs）剧烈促炎反应 (Fig. 2c)，引起TNF, IL1β和IL6 大量表达。Sel1蛋白诱导BMDMs中IκBα磷酸化和降解，提示NF-κB激活 (Fig. 2d)。另外，Sel1刺激可促进MAPKs信号通路中信号因子JNK, ERK和 p38 (Fig. 2d) 的磷酸化和激活。将上述研究拓展至人上，Sel1刺激可激活人周边血液单核细胞 (PBMCs) 中NF-κB和p38信号通路，诱导IL-1β表达 (Fig. 2e) 。以上研究表明Sel1蛋白体外可刺激细胞的炎症反应。将Sel1蛋白通过尾静脉注射入小鼠体内，分析注射6h后体内细胞因子产生变化 (Fig. 2f, g)。Sel1诱导小鼠血清和脾脏产生大量的TNF, IL1β和IL6 (Fig. 2f)。qRT-PCR分析表明Sel1引起脾脏和肾脏的剧烈炎症反应 (Fig. 2g)。以上结果表明Sel1对机体具有较强的促炎能力。Sel1作为一种SCP蛋白具有独特的宿主免疫唤起和上调能力，如在N缺乏和血清刺激的环境下。
Fig 2 a-e Sel1蛋白刺激可诱导BMDMs中细胞因子表达升高
Fig 2 f-g Sel1蛋白刺激可增强血清和脾脏中促炎性细胞因子表达
2. Sel1 激活TLRs介导的免疫反应
随后，研究了Sel1蛋白引起免疫反应动力学和剂量效应。Sel1在促进BMDMs中TNF, IL1β, IL6表达时具有剂量效应。Sel1在低于10ng/mL浓度时可刺激TNF和IL1β表达，当浓度为250–500 ng/ml (Fig. 3 a, b and Supplementary Figure 2a) 时，不能造成炎症反应。Sel1刺激BMDM15min后诱导p38活化(Supplementary Figure 2b)，刺激1h后Tnf和IL1β 和3h后IL6的mRNA水平剧烈升高 (Fig. 3c) 。同理Sel1刺激BMDM中细胞因子水平升高具有剂量和时间效应 (Supplementary Figure 2c, d)。将纯化的Sel1蛋白用蛋白酶K处理后会阻断其与DNA或RNA结合，消除其免疫刺激能力，钝化BMDMs中促炎基因的表达和p38 磷酸化 (Fig. 3d and Supplementary Figure 2e) 。用多粘菌素B（脂多糖抑制剂）预处理Sel1后，也会消除其免疫刺激能力 (Fig. 3d and Supplementary Figure 2e)。
Fig 3 a-c Sel1蛋白引起免疫反应动力学和剂量效应
Sel1蛋白特性除了明确富含半胱氨酸外，其他特征motif结构或结构域仍未知，将Sel1蛋白中的7个半胱氨酸残基用丝氨酸替代后，明显破坏了蛋白的促炎功能 (Fig. 3e, f)。用丝氨酸替代半胱氨酸构建的变异体Sel1蛋白，严重削弱了其激活NF-κB 和 MAPKs的能力，在植物真菌SCP蛋白中已证实。
TLR和CLR是2种真菌感染中主要的模式识别受体，诱导机体促炎反应。哪一种是负责介导Sel1蛋白发挥功能的呢？SHP-2主要介导由酵母多糖和甘露聚糖刺激的细胞因子反应 (Fig. 3g)。Sel1蛋白诱导MyD88和TRIF缺失的BMDMs中的细胞因子反应受钝化减弱 (Fig. 3g)。此外，MyD88/TRIF双敲除的BMDMs中显示Sel1蛋白刺激未能激活NF-κB 或MAPK (Fig. 3h)。以上结果表明Sel1蛋白通过TLRs不是CLRs受体介导，引起机体促炎反应。
Fig 3 d-f Sel1蛋白中半胱氨酸被丝氨酸替代后减少促炎因子的表达 ， g-h 介导Sel1蛋白的细胞膜受体
3. Sel1 通过TLR2和TLR4激活机体免疫反应
鉴于MyD88/TRIF双敲除的巨噬细胞对TLRs和IL1R信号因子不起反应，进而探讨MyD88和TRIF对Sel1蛋白的促炎反应作用。MyD88/TRIF双敲除后，终止了Sel1蛋白的功能 (Fig. 3g, h)，而MyD88或TRIF单敲除，Sel1蛋白诱导BMDMs细胞因子表达的功能受损 (Fig. 4a and Supplementary Figure 3a, b)，提示Sel1可能与MyD88或TRIF皆相结合。已知TLRs是介导真菌感染诱发机体的免疫反应，TLR4招募MyD88和TRIF，因而研究TLR4。但TLR4缺陷型BMDMs 仍会对Sel1刺激诱导细胞因子的显著表达 (Fig. 4b)，同时蛋白印迹结果表明 JNK和ERK激活，且NF-κB和p38TLR4激活 (Supplementary Figure 3c)。这些结果表明除了TLR4，还存在其他TLRs 发挥作用。通过检测BMDMs相关的一组TLR缺陷体，发现TLR2而不是TLR5或7，是介导Sel1蛋白诱导机体促炎反应的一部分 (Fig. 4b and Supplementary Figure 3d)。另外，IL-1R敲除对Sel1蛋白没有显著的影响，因而可将IL-1R信号通路排除。
进一步探索TLR2和TLR4 在 Sel1蛋白中的作用，使用基因敲除和化学阻断实现TLR2/TLR4的双敲除。TLR2/TLR4双敲除后，Sel1蛋白刺激未能引起BMDMs中细胞因子的上调表达，以及NF-κB和MAPKs信号通路激活 (Fig. 4c, d)。应用化学阻断剂将TLR2缺陷型BMDMs中TLR4阻断后，Sel1蛋白刺激未能唤起细胞因子和相关信号通路。此外，为了验证Sel1蛋白与TLR2和TLR4结合，在体外开展了pull-down试验，将Sel1蛋白N端信号肽标记后导入293T 细胞中过表达，后与珠蛋白M2进行免疫共沉淀，通过孵育293T 细胞，裂解细胞，发现：与Sel1蛋白连接的珠蛋白富含TLR2和TLR4，但对照组中没有发现 (Fig. 4e)。以上结果表明Sel1蛋白通过与TLR2或TLR4结合，形成复合物，诱导机体促炎反应。
Fig 4 a-b MyD88或TRIF单敲除后对Sel1蛋白刺激对免疫细胞因子表达的影响
Fig 4 c-d TLR2/TLR4双敲除后，Sel1蛋白刺激对免疫细胞因子表达的影响
Fig 4 e pull-down试验验证Sel1蛋白与TLR2和TLR4结合
4. Sel1 调节免疫反应和发病机理
随后我们检测了C. albicans来源的Sel1蛋白是否会调节宿主体内免疫反应。通过构建sel1/sel1 C. albicans突变株-不表达Sel1蛋白。收集野生型C. albicans培养上清，接种至含10%血清的RPMI-1640培养基中，会唤起所培养的BMDMs中有效的细胞因子反应。
为了检测Sel1 蛋白对侵袭性真菌感染的作用，将野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株静脉注射入小鼠体内。5天后检测免疫反应。与野生型C. albicans相比，SEL1突变株感染的小鼠，血清和肾脏中TNF和IL-6诱导表达量较低 (Fig. 5b)。同时，趋化因子Cxcl1 和 Cxcl2，细胞因子TNF 和 IL6表达量低于C. albicans野生型感染 (Fig. 5c)，揭示了Sel1蛋白在C. albicans诱导免疫反应中的重要作用。与其对应，SEL1突变株造成机体免疫应答受损。感染C. albicans 突变型的小鼠会增加机体多器官的真菌负担，如肾脏、肝脏和脾脏 (Fig. 5d)。小鼠感染sel1/sel1突变型C. albicans，剂量为1×105和5×105 细胞/只，两组的死亡率皆升高 (Fig. 5e, Supplementary Figure 4a)。ICR 小鼠和 C57BL/6 小鼠感染感染sel1/sel1突变型C. albicans会造成更严重的发病率和死亡率 (Fig. 5f)。
为了检测Sel1-TLR2/4 轴在真菌感染中作用，将野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株接种感染TLR2/TLR4双敲除小鼠。与野生型小鼠不同的是，TLR2/TLR4双敲除的DKO小鼠，感染野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株后，死亡率显著不同 (Fig. 5g, Supplementary Figure 4b)，结果证实了Sel1 蛋白在调节机体对真菌感染的免疫保护起重要作用。
Fig 5 a-c 野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株感染对小鼠免疫细胞因子的影响
Fig 5 d野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株感染5天后小鼠肾脏、肝脏和脾脏真菌数量， e-f 野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株感染对小鼠造成的死亡率，g 野生型和sel1/sel1 C. albicans突变株感染TLR2/TLR4双敲除小鼠造成的死亡率
结论
Sel1是人体条件致病菌C. albicans分泌的一种新型富含半胱氨酸蛋白，结果表明在低N且富含血清的条件下会诱导C. albicans大量分泌产生Sel1蛋白，如血液中，这一特征为作为C. albicans 感染的潜在诊断标志。Sel1蛋白通过巨噬细胞和树状突细胞表面的TLR2和 TLR4受体介导，促进机体炎性反应。鉴于目前真菌感染的流行，基于Sel1蛋白免疫激活能力，未来可用于治疗C. albicans 感染。
评论
Sel1是人体条件致病菌C. albicans分泌的一种新型富含半胱氨酸蛋白，C. albicans是机体条件致病真菌，为了明确Sel1蛋白在感染中的作用，本研究通过体外细胞模型，首先探索Sel1蛋白的免疫刺激，激发免疫细胞应答，使细胞因子和趋化因子表达上调，后通过研究得出Sel1蛋白唤起免疫应答的信号受体为TLR2和TLR4，最后通过小鼠模型验证Sel1蛋白在C. albicans感染中作用。本研究清晰地阐述了Sel1蛋白在C. albicans感染机体的作用和潜在机制，为人类预防和治疗C. albicans感染提供新思路。
参考文献：
1. Kullberg, B. J. & Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N. Engl. J. Med. 373, 1445–1456 (2015).
2. Hofs, S., Mogavero, S. & Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J. Microbiol. 54, 149–169 (2016).
3. Netea, M. G. et al. Immune sensing of Candida albicans requires cooperative recognition of mannans and glucans by lectin and Toll-like receptors. J. Clin. Invest. 116, 1642–1650 (2006).
4. Jouault, T. et al. Candida albicans phospholipomannan is sensed through tolllike receptors. J. Infect. Dis. 188, 165–172 (2003).
5. Deng, Z. et al. Tyrosine phosphatase SHP-2 mediates C-type lectin receptorinduced activation of the kinase Syk and anti-fungal TH17 responses. Nat.Immunol. 16, 642–652 (2015).
6. Robinson, M. J. et al. Dectin-2 is a Syk-coupled pattern recognition receptor crucial for Th17 responses to fungal infection. J. Exp. Med. 206, 2037–2051 (2009).
7. Zhu, L. L. et al. C-type lectin receptors Dectin-3 and Dectin-2 form a heterodimeric pattern-recognition receptor for host defense against fungal infection. Immunity 39, 324–334 (2013).
8. Netea, M. G. et al. Trained immunity: a program of innate immune memory in health and disease. Science 352, aaf1098 (2016).
9. Cheng, S. C. et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science 345, 1250684 (2014).
10. Saeed, S. et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science 345, 1251086 (2014).
11. Hise, A. G. et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe 5, 487–497 (2009).
12. Gross, O. et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature 459, 433–436 (2009).
13. van de Veerdonk, F. L. et al. The inflammasome drives protective Th1 and Th17 cellular responses in disseminated candidiasis. Eur. J. Immunol. 41, 2260–2268 (2011).
14. Tomalka, J. et al. A novel role for the NLRC4 inflammasome in mucosal defenses against the fungal pathogen Candida albicans. PLoS Pathog. 7, e1002379 (2011).
15. Gantner, B. N., Simmons, R. M., Canavera, S. J., Akira, S. & Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107–1117 (2003).
16. Richardson, J. P. et al. Candidalysin drives epithelial signaling, neutrophil recruitment, and immunopathology at the vaginal mucosa. Infect. Immun. 86, e00645-17 (2018).
17. Moyes, D. L. et al. Candidalysin is a fungal peptide toxin critical for mucosal infection. Nature 532, 64–68 (2016).
18. Verma, A. H. et al. Oral epithelial cells orchestrate innate type 17 responses to Candida albicans through the virulence factor candidalysin. Sci. Immunol. 2, 17 (2017).
19. Gropp, K. et al. The yeast Candida albicans evades human complement attack by secretion of aspartic proteases. Mol. Immunol. 47, 465–475 (2009).
20. Rapala-Kozik, M. et al. Extracellular proteinases of Candida species pathogenic yeasts. Mol. Oral. Microbiol. 33, 113–124 (2018).
—END—