5000字长文实操心得，手把手教你基因敲除
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随着转录组学、全基因组学和蛋白组学等组学的发展，越来越多的未知功能基因和新基因相继被挖掘出来，其功能急需鉴定，而基因敲除技术是鉴定基因功能最直接的手段，本文以尖孢镰刀菌FPD1基因为例子，详细介绍基因敲除的过程。
一、FPD1基因同源臂的克隆
（1）寻找同源臂位置：
将FPD1 基因在NCBI上进行全基因组序列比对，选取重合度最高且比FPD1 基因序列多出2000bp以上的全基因组序列，然后根据FPD1基因阅读开放框ORF进行左右臂设计，在FPD1基因两端上下游700bp-1400bp左右选取基因的两个同源臂的构建位置，片段大小一般以1000bp比较合适，太长不利于左右臂与载体连接，太小容易导致错配.
（2）酶切位点分析：
载体选择pCT74上潮霉素B和绿色荧光蛋白基因，根据载体潮霉素B和绿色荧光蛋白基因两端的酶切位点和同源臂构建位置选择合适的酶切位点，左臂酶切位点为：KpnI和XhoI，右臂酶切位点为smaI和XbaI，设计引物：FoMsb2-左臂-F/ FPD1 -左臂-R；FPD1 -右臂-F/ FPD1 -右臂-R。
引物设计方法为：保护碱基+酶切位点+特异性引物，在酶切位点选择上要选择目的基因没有的，而质粒上有的，否则会切断目的基因。
然后进行PCR得到FPD1基因的两个同源臂，结束后取4ul pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定同源臂，PCR 50ul反应体系如下：
ddH2O 35.75ul
dNTP Mixture(2.5mM) 4ul
模板DNA（野生型） 1ul
正向引物 2ul
反向引物 2ul
Taq DNA聚合酶 0.25ul
10Xpcr buffer 5ul
反应条件为：94℃ 4min；94℃ 40s；61℃ 40s；72℃ 1min；40个循环；72℃ 延伸10min。
二、同源臂回收、连接和转化
1、PCR产物回收
将扩增出同源臂的PCR产物经过电泳检鉴定后，采用生工公司Sanprep胶柱式DNA胶回收试剂盒进行会回收和连接。
（1）将电泳正确的PCR产物放在凝胶成像仪中用无菌手术刀进行目的片段切割，放入1.5ml无菌离心管中并称重。
（2）按照1:3比例加入buffer B2，即100mg凝胶块加入300ul buffer B2 ，最后将其置于50℃水浴10 min，直至胶融化，中间需要每2分钟颠倒一次。
（3）而后将融化的液体加入吸附柱中，8000 r/min，室温离心30 s。
（4）去掉收集管中的废液，把吸附柱放回收集管中。若DNA溶胶液过多时可重复上述步骤，而预期产量较大时，可以把液体加到合适数量的吸附柱中。
（5）加入500 ul wash solustion（已用无水乙醇稀释），9000 r/min，室温离心30 s后去废液，然后重复以上步骤5一次。
（6）9000 r/min室温离心1 min
（7）把吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向柱子中间的吸附膜中央悬空加入30 ul Elution Buffer ，室温放置2 min，9000 r/min室温离心1 min，溶液即回收成功。如有需要可以将离心后的溶液再次加入吸附柱中再次离心，可进一步提高得率。
（8）取2ul回收产物进行1%琼脂糖凝胶检测。
2、PCR回收产物连接
回收产物连接用TAKALA公司的PMD18-T vector cloning kit试剂盒连接，将PCR回收产物同源臂左臂和右臂片段分别PMD-18T载体上，连接体系如下：
Slution I 溶液 5ul
PCR回收产物 4.5ul
PMD-18T vector 0.5ul
将上述溶液加入到PCR管中上下颠倒混合后用封口膜封紧管口，放入16℃水浴锅中一晚连接过夜，即可将回收产物同源臂连接到PMD-18T载体上，制成连接产物。
3、连接产物转化
A、感受态细胞制作
（1）将低温甘油保存的DH5α菌株划线接种到LB固体培养基上，37℃培养16-18h，待长出单菌落后，将单菌落挑取一个挑到10ml 的LB液体培养基上，37℃，250r/min，摇床培养10-12h。
（2）将培养的菌液吸取0.2ml到9.8ml的 LB液体培养基中（稀释50倍），继续37℃，250r/min摇床培养至OD600值为0.3-0.4。
（3）将10ml OD600值为0.3-0.4的菌液分装到5支事前预冷过的2ml离心管中，在冰上放置10min，4℃，4000r/min离心5min。
（4）弃上清，用400ul经过预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl2 溶液使菌体重悬，4℃，4000r/min离心5min。
（5）弃上清，用200ul经过预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl2 溶液再次重悬菌体，即可获得感受态细胞，放置4℃保存，使用时需要放在冰上使用，如需要放在-80℃长期保存，则需要用0.1mol/L+15%甘油重悬菌体后分装保存。
B、连接产物转化
（1）以无菌枪头吸取10ul连接产物到1ml装有200ul感受态细胞的离心管中，移液枪轻轻吹打，立即放置冰浴30min。
（2）将离心管放置42℃恒温水浴锅中水浴热激90s，迅速将离心管转移到冰上然后冰浴2min。
（3）配置没有加入抗生素的LB液体培养基，吸取500ul液体培养基到离心管中，36℃，200r/min摇床45-60min。
（4）吸取200ul菌液到含有100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中，均匀涂布，在无菌的超净台上将其吹干。
（5）将平板放置37℃培养箱，倒置放置，培养12-16h，待可以看到菌落长出即可完成转化。
三、克隆载体酶切鉴定
在LB平板中挑取10个单菌落至10ml的含100ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，以37℃。250r/min条件下培养12-16h。
1、用碱裂解法提取质粒DNA，方法如下：:
A溶液配制：
溶液1：500mmol/L的 葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris，PH8.0
溶液2：0.2mol/L NaOH，1%SDS
溶液3（100ml）:60ml 5mol/L KAc、11.5ml 冰乙酸、28.5ml无菌水
TE溶液：10mmol/L Tris、1mmol/LEDTA、PH8.0
B步骤：
质粒的小量提取方法如下：
(1)取2mL菌液到2mL无菌离心管中，12,000r/m离心2min;
(2)加入300 ul 4°C预冷的溶液1，震荡混匀；
(3)加入600μl溶液2，颠倒混匀后置于冰上；
(4)加入450μl溶液3，混匀置于冰上5 min，12 000 r/m离心10 min；
(5)取上清加入2mL离心管，加入等体积的酚:氯仿(24：1)，颠倒混匀，12,000 r/m 离心10min。
(6)取上清加入等体积氯仿混匀，12000 r/m离心10 min；
(7)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后置于-20C静置30 min；
(8)12,000 r/m离心10 min，去上清，用75%乙醇洗涤2次，风干；
(9)用30μL的含RNaseA的TE溶液溶解质粒DNA，-20°C保存。
2、克隆载体酶切鉴定
分别提取3ul质粒，用组合为Kpnl/XhoI和smaI/XbaI限制性内切酶对Foc4-fpdl-左臂重组质粒和Foc4-fpdl-右臂重组质粒进行双酶切鉴定。体系如下:
Foc4-fpdl-左臂重组质粒 3ul
Fsatdiges KPnI 1ul
Fsatdiges XhoI 1ul
10xFsatdigest buffer 2ul
ddH2O 13ul
Foc4-fpdl-右臂重组质粒 3ul
Fsatdiges smaI 1ul
Fsatdiges XbaI 1ul
10xFsatdigest buffer 2ul
ddH2O 13ul
37℃恒温循环水浴锅中酶切1 h，取5ul酶切产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，对比DNA Marker DL10000条带，选出与目的条带在同一位置的转化子，并送往公司进行目的片段测序。鉴定正确的转化子分别命名为Foc4-fpdl-左臂-T、Foc4-fpd1-右臂-T。
四、FPD1基因敲除载体的构建
A、PCT74质粒的提取：
(1)将-80°C保存的含pCT74质粒菌株在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上活化12小时;
(2)挑取单菌落接种至含有100ug/mL氨苄青霉素的20ml LB液体培养基中,37℃,180r/min振荡培养过夜，约为12 h;
(3)取2mL菌液到2mL无菌离心管中，12,000r/m离心2min;加入300 ul 4°C预冷的溶液1，震荡混匀；
(4)加入600μl溶液2，颠倒混匀后置于冰上；
(5)加入450μl溶液3，混匀置于冰上5 min，12 000 r/m离心10 min；
(6)取上清加入2mL离心管，加入等体积的酚:氯仿(24：1)，颠倒混匀，12,000 r/m 离心10min。
(7)取上清加入等体积氯仿混匀，12000 r/m离心10 min；
(8)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后置于-20C静置30 min；
(9)12,000 r/m离心10 min，去上清，用75%乙醇洗涤2次，在超净台风干；
(10)用30μL的含RNaseA（10ug/ml）的TE溶液溶解质粒DNA，-20°C保存。
B、PCT74质粒线性化以及回收
提取质粒，随后根据pCT74质粒和合成的特异性引物的酶切位点要求，用KpnI/XhoI对pCT74质粒进行双酶切，体系如下:
PCT74质粒 3ul
Fsatdiges KPnI 1ul
Fsatdiges XhoI 1ul
10xFsatdigest buffer 3ul
ddH2O 12ul
37°C恒温循环水浴锅中水浴lh, 将3μl酶切产物于1%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯下用干净的手术刀片将正确的片段切下,用胶回收试剂盒进行切胶回收,具体方法如：
（1）将电泳产物放在凝胶成像仪中用无菌手术刀进行目的片段切割，放入1.5ml无菌离心管中并称重。
（2）按照1:3比例加入buffer B2，即100mg凝胶块加入300ul buffer B2 ，最后将其置于50℃水浴10 min，直至胶融化，中间需要每2分钟颠倒一次。
（3）而后将融化的液体加入吸附柱中，8000 r/min，室温离心30 s。
（4）去掉收集管中的废液，把吸附柱放回收集管中。若DNA溶胶液过多时可重复上述步骤，而预期产量较大时，可以把液体加到合适数量的吸附柱中。
（5）加入500 ul wash solustion（已用无水乙醇稀释），9000 r/min，室温离心30 s后去废液，然后重复以上步骤5一次。
（6）9000 r/min室温离心1 min
（7）把吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向柱子中间的吸附膜中央悬空加入30 ul Elution Buffer ，室温放置2 min，9000 r/min室温离心1 min，溶液即回收成功。如有需要可以将离心后的溶液再次加入吸附柱中再次离心，可进一步提高得率。
（8）取2ul回收产物进行1%琼脂糖凝胶检测。
C、目的基因同源臂左臂片段的获得
用KpnI和XhoI对Foc4-fpdl-左臂-T进行双酶切，随后电泳进行胶回收，酶切体系如下：
Foc4-fpdl-左臂-T 3ul
10xFsatdiges缓冲液 3ul
Fsatdigest KPnI/ Fsatdigest XhoI 各1ul
ddH2O 12ul
37°C恒温循环水浴锅中水浴lh, 将3μl酶切产物于1%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯下用干净的手术刀片将正确的片段切下,用胶回收试剂盒进行切胶回收,得到回收的Foc4-fpdl-左臂片段，具体方法如：四、B
五、线性化PCT74质粒与左臂片段连接和转化
A线性化PCT74质粒与左臂片段连接
将线性化的pCT74质粒与回收得到的Foc4-fpdl-左臂片段进行连接，用TAKALA的T4 DNA Ligase试剂盒进行连接，连接体系如下：
T4 DNA Ligase buffer 3ul
Foc4-fpdl-左臂片段 15ul
线性化的pCT74质粒 3ul
ddH2O 3ul
T4 DNA Ligase 1ul
将上述试剂依次加入PCR管中，混匀，用封口膜封口，16°C 低温循环水浴锅连接过夜约12h。
B酶连产物转化
将同源臂Foc4-fpdl-左臂片段与线性化pCT74质粒酶连产物转化大肠杆菌E.coli DH5a.
具体转化方法如下:
1、向含有100.0μL感受态细胞的1.5mL无菌离心管中加入5.0uL连接产物，轻轻混匀，立即放在冰上放置30min,准确计时;
2、将离心管迅速放进42C恒温循环水浴锅中热击90s后迅速取出,立即转至冰上冰浴2min，准确计时; .
3、向离心管中加入400.0uL LB液体培养基(不含氨苄青霉素),混匀，37℃，200r/min摇床培养1h;
4、取200.0uL液体将涂布在含有100.0ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基.上，在超净工作台中将平板吹干;
5、将平板在37C培养箱中倒置培养过夜，约12h后可观察到菌落。
六、Foc4-fpdl-左臂-pCT74重组载体酶切分析鉴定
挑选上述单菌落摇菌提质粒，用kpnl/XhoI组合对用pCT74构建的质粒双酶切鉴定。体系如下:
PCT74重组质粒 1ul
10xFsatdiges缓冲液 2ul
Fsatdigest KPnI/ Fsatdigest XhoI 各1ul
ddH2O 15ul
37℃恒温循环水浴锅中水浴1h,取5uL酶切产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切结果。对比DNA Marker DL10000所对应的条带选出正确转化子。将正确的转化子命名为Foc4-fpd1-左臂-pCT74.
七、Foc4-fpdl-左臂-pCT74载体线性化以及回收
用smaI/XbaI对Foc4-fpd1-左臂-pCT74质粒进行线性化，体系如下:
Foc4-fpdl-左臂-pCT74 1ul
Fsatdiges smaI 1ul
Fsatdiges XbaI 1ul
10xFsatdigest buffer 2ul
ddH2O 15ul
37°C恒温循环水浴锅中水浴lh, 将3μl酶切产物于1%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯下用干净的手术刀片将正确的片段切下,用胶回收试剂盒进行切胶回收。
八、获得同源臂右臂片段
用smaI/XbaI对Foc4-fpdI-右臂-T质粒进行双酶切，体系如下:
Foc4-fpdl-右臂-T 3ul
10xFsatdiges缓冲液 3ul
Fsatdigest KPnI/ Fsatdigest XhoI 各1ul
ddH2O 12ul
37°C恒温循环水浴锅中水浴lh, 将3μl酶切产物于1%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯下用干净的手术刀片将正确的片段切下,用胶回收试剂盒进行切胶回收,得到回收的Foc4-fpdl-右臂片段，具体方法如：四、B
十、同源臂右臂与线性化Foc4-fpdl-左臂-pCT74质粒连接与转化
A同源臂右臂与线性化Foc4-fpd1-左臂-pCT74质粒酶连
将切胶回收的Foc4-fpd1-右臂片段与Foc4-fpdl-左臂-pCT74片段进行连接,体系如下:
T4 DNA Ligase buffer 3ul
Foc4-fpdl-左臂片段 15ul
线性化Foc4-fpd1-左臂-pCT74质粒 3ul
ddH2O 3ul
T4 DNA Ligase 1ul
将上述试剂依次加入PCR管中，混匀，用封口膜封口，16°C 低温循环水浴锅连接过夜约12h。
B酶连产物转化
将同源臂Foc4-fpdl-右臂片段与线性化Foc4-fpd1-左臂-pCT74质粒酶连产物转化大肠杆菌E.coli DH5a.
具体转化方法如下:
1、向含有100.0μL感受态细胞的1.5mL无菌离心管中加入5.0uL连接产物，轻轻混匀，立即放在冰上放置30min,准确计时;
2、将离心管迅速放进42C恒温循环水浴锅中热击90s后迅速取出,立即转至冰上冰浴2min，准确计时; .
3、向离心管中加入400.0uL LB液体培养基(不含氨苄青霉素),混匀，37℃，200r/min摇床培养1h;
4、取200.0uL液体将涂布在含有100.0ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基.上，在超净工作台中将平板吹干;
5、将平板在37C培养箱中倒置培养过夜，约12h后可观察到菌落。
十一、Foc4-fpd1-左臂-pCT74-右臂载体酶切鉴定
挑选单菌落在LB液体培养基中摇菌提取质粒，用KpnI/XhoI, Xbal/smaI 和KpnI/XbaI三组限制性内切酶对用Foc4-fpdI-左臂-pCT74 构建的重组质粒进行双酶切。
体系如下:
Foc4-fpdI-左臂-pCT74 构建的重组质粒 1ul
10xFsatdiges缓冲液 2ul
Fsatdigest内切酶 各1ul
ddH2O 15ul
37°C恒温{循环水浴锅中水浴lh,取5uL酶切产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切结果。对比DNA Marker DL10000所对应的条带,选出正确的转化子并送往上海生工测序。将鉴定正确的转化子命名为Foc4-fpd1-左臂-pCT74-右臂.并将其保存在-80°C冰箱。
十二、PEG介导原生质体转化
A、溶液配制：
酶裂解液液配置：10mg/ml Drease、10mg/ml溶壁酶，冷的0.8mol/L的Nacl配置，28℃，70r/minn加摇床溶解30min，用0.22微米的微孔过滤器过滤,除去杂质,离心,2ml离心管分装保存于20℃。
STC溶液配制：1.2mol/L sorbitol、10mol/L Tris-HCL(ph7.5)、50mol/L Cacl2
PTC溶液配制：40%PEG，用STC配置，用0.22微米的微孔过滤器过滤（现配现用）
再生培养基：1L水、274g白砂糖、18g琼脂粉、土豆200g
B、转化步骤：
（1）从活化的FOC4菌株新鲜平板挑取适量菌丝接种到液体PDB中，28摄氏度，180r/min，恒温摇床3天培养出尖孢镰刀菌病原菌菌液，无菌操作下，用3层擦镜纸过滤菌液，除去菌丝，得到孢子悬浮液。
（2）吸取5ml菌液到100ml PDB培养基中，28摄氏度，120r/min,培养一夜，一般12h。
（3）3层灭菌过的擦镜纸过滤菌液，收集菌丝，用已经灭菌的0.8mol/L的 Nacl充分清洗菌体。
（4）将菌体放入50ml三角瓶，加入10ml酶裂解液，80r/min，摇床酶解2小时，需要定时观察，当视野出现有90%的原生质体时，停止酶解。
（5）用灭菌过的2层擦镜纸过滤酶裂解液，收集滤液，并用灭菌后的0.8mol/L的 Nacl 10ml稀释菌液，3000r/min离心10min，在超净台缓慢倒掉上清，加入10ml STC溶液，清洗滤液，倒掉上清，再次加入1ml STC溶液，调整原生质体浓度使其达到3x107cfu/ml，则可得原生质体。
（6）将原生质体吸取200ul到1.5ml离心管中，取5ug的FPD1-左臂- pCT74-右臂转化片段缓慢加入200ul原生质体中，缓慢轻轻晃动混匀，室温静置半小时，随后逐滴加入1.25ml PTC溶液（现配现用），混匀放置20 min。
（7）随后将上述原生质体加入在含有50ug/ml潮霉素B和100ug/ml氨苄青霉素的已经冷却到50℃再生培养基上，用手轻微摇晃培养皿混匀，再次倒入再生培养基做成双层平板，28℃，倒置放置培养3-7天，长出的单菌落，即是我们要的转化子。
END
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