改）科研 | CARDIOVASC RES：靶向心肌细胞中的高丰度环状RNA circSlc8a1可以改善压力负荷诱导的心肌肥厚
编译：KT!，编辑：景行、江舜尧。
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环状RNA在正常小鼠和人类的心脏中均有表达，但其在心肌中的功能关系目前还不明确。心肌细胞中的环状RNA circSlc8a1（钠钙交换体基因）在心肌细胞中表达丰度极高。因此，本研究将对circSlc8a1在心脏中的作用作一阐述。研究首先使用芯片进行miRNA筛选，共筛选出752种通过内源性心肌细胞circSlc8a1 pull-down所得的miRNA。其中，miRNA-133a高度富集在circSlc8a1 pull-down的片段中，而这是一种公认的与心脏肥厚相关的miRNA。接下来使用荧光素酶和反向pull-down的方法对circSlc8a1和miRNA-133a进行功能学验证。在体内实验中，用AAV-9介导circSlc8a1的敲除改善了压力负荷诱导的心脏肥厚，而过表达则导致了心衰。分子生物学方法发现miRNA-133a的下游靶点srf、ctgf、Adrb1、Adcy6受到circSlc8a1敲除或者过表达的直接调控。因此，心肌细胞中的circSlc8a1充当了miRNA-133a的内源性海绵，未来可能成为心脏肥厚的治疗新靶点。
论文ID
原名：Targeting the highly abundant circular RNA circSlc8a1 in cardiomyocytes attenuates pressure overload induced hypertrophy
译名：靶向心肌细胞中的高丰度环状RNA circSlc8a1可以改善压力负荷诱导的心肌肥厚
期刊：Cardiovascular Research
IF：8.168
发表时间：2020年5月
通讯作者：Roger Sik-Yin Foo
通讯作者单位：新加坡国立大学心血管研究所，MD6转化医学中心
DOI号：10.1093/cvr/cvz130
实验设计
结果
Argonaute 2（AGO2）是诱导沉默复合物（RISC）的重要成员，该复合物调节miRNA介导的基因沉默过程。免疫沉淀（RIP）试验在原代心肌细胞中的AGO2抗体中检测到circSlc8a1是最丰富的circRNA，是核糖核蛋白的一部分。circSlc8a1的序列在整个脊椎动物物种中高度保守，AGO2免疫沉淀数据集的分析（doRiNA）在circSlc8a1序列中发现了许多AGO2的占据位点（图1A）。由于circSlc8a1在心肌细胞中高表达，并且胞浆中的circRNA在很大程度上起着内源性miRNA海绵的作用，因此，有必要探索与circSlc8a1相互作用的心肌细胞miRNA。作者设计了针对circSlc8a1 backsplice junction的生物素标记的DNA探针，进行生物素pull-down。事先用小鼠HL-1房室细胞系对探针的特异性进行了测试，与随机对照探针（图S1A）相比，证明了circSlc8a1高度富集。在原代成年小鼠心肌细胞中， circSlc8a1 pull-down后提取的总RNA电泳图显示出典型的miRNA模式（图1B）。接下来从circSlc8a1 pull-down的miRNA中，筛选了752个miRNA片段并进行锁核苷酸修饰的miRNA qPCR测定。结果发现只有14个miRNA与circSlc8a1结合（图1C）。而当进行Benjamini–Hochberg校正并且幅度变化> 3时，只有5个候选miRNA（miR-133a，miR133b，miR-208a-5p，miR-22和miR-34a），进一步经过Bonferroni校正只有miR-133筛选出来（表1）。由于与circSlc8a1结合的miR-133和少数miR-1在心肌细胞中富集，且其在心肌细胞病理生理中起关键作用，因此，研究接下来验证了这种结合的功能相关性。首先克隆了完整的circSlc8a1序列，将其插入萤光素酶报道分子的下游（Luc-circSlc8a1 图1D），当circSlc8a1与每个miRNA模拟物共转染时，与circSlc8a1相关的miRNA将抑制萤光素酶活性，结果显示，与对照组相比，miR-1，miR-133a和miR-133b明显表现出荧光素酶活性抑制作用（图1D）。接下来，使用RNA hybrid数据库以<-18 kcal / mol的最小自由能分析了circSlc8a1与miR-133a和miR-1的序列，预测了miR-133a的10个靶点以及 miR-1的3个潜在靶点（图1E）。相应的人的circSLC8A1序列则含有17个miR-133a靶点和1个miR-1潜在靶点（图S1B）。而向miR-133a和miR-1模拟物的种子序列引入碱基突变则消除了萤光素酶测定的抑制作用（图1F）。为了进一步验证这些数据，使用分离的小鼠心肌细胞重复生物素pull-down实验，发现与circSlc8a1结合的miR-133a和miR-1分别呈180倍和18倍的比例关系（图1G）。此外，还通过反向pull-down，即使用生物素化的miR133a和miR-1模拟物测试内源性circSlc8a1也验证了上述结果。合成的生物素化的miRNA模拟物的特异性在HEK-293T细胞中利用它们的已知靶点进行了验证（图1SC）。在初生新生儿和成年小鼠心肌细胞中，与circSlc8a1结合的miR-133a富集丰度达四倍至五倍，但却不是在miR-1中（图1H和I）。因此，研究最后证明了内源性circSlc8a1与miR-133a之间的相互作用， miR-1的作用相对不明显。使用荧光原位杂交（FISH）对circSlc8a1进行亚细胞定位发现，在HL-1细胞和原代成年心肌细胞中circSlc8a1的胞质定位一致（图1J），此外，双重FISH证实了miR-133a和circSlc8a1之间的共定位（图1K）。
图1. A circSlc8a1和miR-133a的直接作用。A. AGO2结合位点以及circSlc8a1基因座在脊椎动物中的高度保守序列，红箭头示qPCR的引物，sanger 测序法验证了circSlc8a1的backsplice junction；B.电泳图显示在circSlc8a1中出现典型的miR-133a谱（箭头）；C.circSlc8a1 pull-down的片段进行双向聚类分析的热图，行代表miRNA，列代表样本重复，粗体代表具有统计学意义的miRNA;D.将circSlc8a1序列克隆至荧光素酶基因的下游，与相关的miRNA模拟物共转染HEK-293T细胞来验证circSlc8a1-miRNA的结合作用；E.RNAhybrid数据库注释的miR-133a和miR-1与circSlc8a1的结合位点分别为10个和3个。F.circSlc8a1与野生型和突变型miR-133a和miR-1模拟物共转染HEK-293T后的荧光素酶活性；G. RT-qPCR分析原代小鼠成年心肌细胞裂解液中生物素化的circSlc8a1探针和对照探针下pull-down的miRNA结合量的比较；H和I.RT-qPCR分析原代小鼠新生心肌细胞（H）和成年心肌细胞(I)裂解液中的与生物素化miR-1, miR-133a或对照RNA模拟物共转染后的circSlc8a1表达量；J.FISH实验(红色) 表明，circSlc8a1在原代成年小鼠心肌细胞和房HL-1 细胞系定位在胞浆中。核使用DAPI染色 (蓝色)；(K). 双重FISH实验表明circSlc8a1 (红色)和miR-133a(绿色) 在HL-1细胞中的共定位.核蓝色。
图 S1A. circSlc8a1探针在小鼠HL-1房室细胞系中高度富集；S1B：RNAhybrid数据库注释的人的miR-133a和miR-1与circSlc8a1的结合位点分别为17个和1个；S1C: 在HEK-293T细胞中利用miRNA的已知靶点对合成的生物素化的miRNA模拟物的特异性进行验证。
表1. circSlc8a1 pull-down片段中富集的miRNA。a:只有miR-133在经过Bonferroni校正后具有统计学意义。
2 circSlc8a1与翻译可能无关
核糖体RIP实验证实了小鼠circSlc8a1与核糖体之间具有强关联，circSlc8a1可能参与或调节翻译。circSlc8a1的环状转录本存在天然起始密码子，但没有终止密码子。因此，作者构建了一个基于向量的系统，将circSlc8a1序列与血凝素（HA）标记物（S2A）融合在一起，只有当跨越backsplice junction翻译时才可能检测到标记物，用C末端融合mCherry-HA标记物的构建体和空载体用作对照（S2A）。RT-PCR和Sanger测序证实了circSlc8a1的有效表达是RNase-R非依赖性的（图S2B和C）。此外，免疫印迹发现mCherry-HA构建体出现了阳性信号，但circSlc8a1-HA构建体未检测到75 kDa产物的信号（S2D），说明 circSlc8a1不太可能调节翻译。
图S2A. circSlc8a1序列与血凝素（HA）标记物融合的构建体；S2B、C：RT-PCR和Sanger测序证实circSlc8a1的有效表达是RNase-R非依赖性的；S2D：免疫印迹法mCherry-HA构建体出现了35KD产物，而circSlc8a1-HA构建体未检测到75 kDa产物的信号。
3 在体内降低circSlc8a1丰度改善了心脏肥厚和心衰
miR-133a是心脏肥大的关键调节剂，过表达miR-133a会抑制小鼠心脏肥大。以上研究结果表明miR-133和circSlc8a1之间存在直接的相互作用，因此作者假设对circSlc8a1的抑制会释放miR-133a，从而减轻心脏肥大。首先，使用RNA干扰技术敲除小鼠心脏中的circSlc8a1；通过腺相关病毒载体系统（AAV9）靶向circSlc8a1，这个系统表达的短发夹RNA（shRNA）可以靶向circSlc8a1的backsplice junction（circSlc8a1-i；图2A）。该构建体由心肌特异性肌钙蛋白T启动子（cTnT）驱动，其与AAV9血清型一起具有心脏特异性。将表达细菌b-半乳糖苷酶shRNA（LacZ-i）的构建体作为对照。实验开始将AAV9病毒注射入3周大的小鼠体内，然后注射5周后横断主动脉致主动脉缩窄（TAC）性压力负荷性心脏肥大（图2A）。TAC后5周，超声心动图分析发现对照组LacZ-i小鼠发展为心肌肥大，circSlc8a1-i组小鼠（图2B）的心脏功能显著改善，左心室内径减小（图2C），室间隔厚度减小（图2D），心肌细胞宽度减小（图2E和S3A），心脏重量下降（图2F和图S3A）。分子水平上，与对照相比，circSlc8a1-i心脏的应激反应相关基因表达降低（图2G–I）。与对照组相比，circSlc8a1-i心脏中circSlc8a1的丰度降低了90％以上（图2J），而其同源线性Slc8a1的丰度却未受到明显影响（图2K），shRNA病毒系统的GFP荧光也表现出一致的表达谱（图S3A）。如预期的那样，在circSlc8a1-i心脏中，miR-133a的总丰度没有变化（图2L），但是与对照相比，miR-133a靶蛋白如血清反应因子（SRF）和结缔组织生长因子（CTGF）的表达明显降低（图2M）。虽然circSlc8a1的丰度与LacZ-i对照组相比，TAC手术后明显减少（图2J），但在不同时间点的监测发现在TAC后circSlc8a1的丰度基本保持不变（图S3B）。而miR-133a在TAC后1周减少，随后在TAC后3周恢复正常（图S3B）。
图2.体内敲除circSlc8a1改善了心脏肥厚(A)设计针对backsplice junction 的 circSlc8a1 RNAi以及动物实验步骤. (B–D)超声心动图分析射血分数(B) 左室收缩期内径(LVID-s；C),收缩期室间隔内径 (IVS-s；D)；E:心肌细胞宽度测量；F：心脏重量；（G-L）RT-qPCR 分析提取的心肌细胞中典型病理肥厚基因：Myh7、Nppa、Nppb以及circSlc8a1、Slc8a1、miR-133a；M：免疫印迹分析小鼠心肌细胞裂解液中的miR-133a的靶点：SRF、CTGF。
图3SA. circSlc8a1-iTAC-小鼠的心脏大小和心肌细胞宽度肉眼观；3SB：TAC术后不同时间段检测到的circSlc8a1、miR-133a、Slc8a1的表达量。
4 过表达circSlc8a1在体内诱发心力衰竭
已有研究表明miR-133a基因敲除小鼠会致胚胎晚期或新生儿死亡，而存活的突变小鼠则会死于扩张型心肌病（DCM）和HF。因此，研究者再次使用AAV9在体内构建circSlc8a1过表达载体。过表达构建体（circSlc8a1-OE）的设计与上述体外表达研究中所使用的相似，而对照组则是内含子序列相同而约90％circSlc8a1序列不同的构建体（circControl；图3A）。CircSlc8a1-OE首先在HEK-293T细胞上用RT-PCR和Sanger测序证实了circSlc8a1（S4A）的环化，然后用Northern印迹在原代成年心肌细胞中证实了circSlca81的过表达（图S4B）。接下来将病毒以P1或P2的形式注入小鼠体内，可以观察到注射circControl的新生小鼠正常发育，而circSlc8a1-OE小鼠则在转导后3至4天出现死亡（图3B）。存活的小鼠在第10天处死，GFP荧光和mRNA显示了在circControl和circSlc8a1-OE（S4C）小鼠之间构建体的表达水平是不同的。与对照组相比， circSlc8a1-OE注射的小鼠心脏相对重量显著增加（图3C）。在D10时的超声检测结果虽然不可靠，但在circSlc8a1-OE心脏组织切片以及尸体解剖时均发现有明显的心脏扩张迹象（D4；图3D）。天狼星红染色未发现明显心肌纤维化迹象（图S4D）。在circSlc8a1-OE的小鼠中证实了circSlc8a1的显著过表达（图3E）。Slc8a1和miR-133a的水平没有变化（图S4E和F），但在D10 时circSlc8a1-OE小鼠中心脏应激相关标志物明显上调（图3F–H），而D10以后心脏应激标志物逐渐正常化（未显示），这可能提示存在代偿性机制。此外，在D10 circSlc8a1-OE心脏中，miR-133a的靶点（Ctgf和Srf）显著上调（图3I和J），进一步说明circSlc8a1-OE阻遏了miR-133a，从而导致其靶点上调。研究表明，miR-133a还可以通过靶向肾上腺素受体β1（Adrb1），Adyc6和Prkacb来控制b1-肾上腺素能受体级联反应的多个组成部分。相应的在circSlc8a1-OE小鼠心脏中，发现与对照相比（图3K–M）以上靶点也上调。相反，在circSlc8a1-i心脏中，Srf, Ctgf, Adrb1,和腺苷酸环化酶6（Adcy6）显著下调，而Prkacb则没有下调（图S4G–I）。还有报道带有decoy序列的miR-133a海绵会改变新生儿心肌细胞大小。同样地，研究者也发现circSlc8a1-OE转导的新生儿心肌细胞表现出细胞表面积显著增加20％（图3N）。总之，这些研究结果表明circSlc8a1过表达导致miR-133a靶基因发生变化，并在体内诱导了HF的发生。
图3.过表达circSlc8a1在体内诱导了心衰的发生.(A) circSlc8a1过表达载体的结构模式图(B) 注射了心肌细胞特异性的AAV9 circControl或circSlc8a1-OE的P1-2 新生小鼠的生存曲线(C)心脏相对重量(D)不同时间段取自circControl和circSlc8a1-OE组小鼠的心脏长轴H&E染色，CircSlc8a1-OE D4 的心脏尸体解剖所得；(E–M) RT-qPCR分析提取的心肌细胞应激相关基因的表达以及circSlc8a1, Ctgf, Srf, Adrb1, Prkacb和Adcy6；(N) 两组小鼠心肌细胞的细胞表面积分析 (左)，免疫组化染色后对两组小鼠心肌细胞进行免疫荧光显微镜检测（右），核DAPI染色（蓝色），a-肌球蛋白染为红色。
图S4A. HEK-293T细胞上用RT-PCR和Sanger测序证实了circSlc8a1的环化；S4B：Northern印迹在原代成年心肌细胞中证实了circSlca81的过表达；S4C：D10，GFP荧光和mRNA显示了circControl和circSlc8a1-OE（S4C）小鼠构建体的表达水平；S4D：天狼星红染色示心肌纤维化无明显差异；S4E-F：两组间Slc8a1和miR-133a的表达水平；S4G-K: circSlc8a1-i 心脏中Arbd1、Adcy、Srf, Ctgf表达下降，而Prkacb无变化。
讨论
已有研究表明，在活性氧处理的H9c2成肌细胞中发现circSlc8a1上调，并通过miR-133a海绵作用促进了心肌细胞凋亡，而在动物模型中，减少circSlc8a1的丰度可减轻缺血-再灌注（I/ R）诱导的心肌细胞凋亡和心肌梗塞，circSlc8a1敲除模型中，miR-133a的靶标细胞死亡诱导蛋白（CDIP1）出现减少，而该靶标原本在I/R期间心脏中是上调的。同样，作者的研究通过对circSlc8a1的所有潜在结合伴侣进行了无偏移miRNA筛选，也证明了circSlc8a1与miR-133a之间的相互作用。此外，研究还探索了circSlc8a1与压力负荷诱导的心肌肥大的相关性，其中miR-133在心脏肥大中的作用是众所周知的。作者在体内使用敲除和过表达的方法，进一步验证了circSlc8a1与miR-133的关系。虽然也存在circSlc8a1与miR-1相互作用的证据，但一下证据可以排除其可能性（i）miRNA筛选中的miR-1富集仅约两倍，而Bonferroni校正后只有miR-133的富集具有统计学意义（ii）在两个不同的原代心脏细胞中，使用miR-1作为诱饵的circSlc8a1在反向pull-down测定中没有出现富集现象。此外，在小鼠circSlc8a1中，miR-133a有10个潜在的相互作用位点，而miR-1只有3个，而在人circSLC8A1中miR-133a有17个潜在的潜在结合位点，而miR-1只有1个。因此，如果人为的异位过表达miR-1时，circSlc8a1和miR-1可能出现相互作用，但可能缺乏功能上有意义的内源性相互作用。
在单次敲除实验中（图2J），circSlc8a1仅在TAC处理后下调，但是经过多个重复实验后，包括不同时间点的Sham/TAC，发现circSlc8a1并没有下调，相一致地，TAC并未改变CircSlc8a1的水平（S3B）。尽管在TAC过程中circSlc8a1的丰度没有变化，但是circSlc8a1和miR-133a之间的直接内源性相互作用说明circSlc8a1可以作为抑制心肌肥大的靶标。其他研究也表明在小鼠中TAC诱导的肥大和心肌梗塞中circSlc8a1的丰度没有变化。在临床实验中，作者和其他人都没有观察到衰竭和未衰竭心脏之间circSLC8A1水平的显著差异。但是，近期研究发现，与健康对照组相比，DCM中的circSLC8a1明显上调，比较circRNA与（circRNA+linearRNA）的比例发现circSLC8a1在DCM患者中也是升高的。这可能是由于所研究的HF的不同形式引起的区别，也可能是临床研究是在血标本中进行的，其circSLC8a1的细胞来源不仅仅是心肌细胞。
据报道miR-133a在小鼠和人类的心脏肥大过程中显著下调，但是也有报道miR-133a水平仅在TAC后1周短暂降低，在TAC后3周重新恢复正常。在作者的TAC模型中，也观察到1周时的miR-133a瞬时下调，3周后又恢复正常。所以，有可能circSlc8a1-miR-133a 在心脏应激过程中本身受到调控，可能心肌应激期间miR-133a受到显著sequester。研究者也进行了实验以分析假手术组与TAC组心肌细胞中circSlc8a1-miR133结合的变化，但结果尚无定论。但是，通过miRNA qPCR实验，FISH，pull-down和荧光素酶测定，研究者发现了circSlc8a1与miR-133a之间的内源性相互作用，当前研究发现过表达miR-133a可以在体外和体内减轻心脏肥大，相一致的，作者发现内源性circSlc8a1的减少也可抑制病理性肥大。相反，体内miR-133a的敲除表现出两种有害表型：（i）胚胎期死亡或者出生后死亡，表现为心脏室间隔缺损，心室心房扩张；（ii）存活到成年的小鼠将发展为DCM。同样，作者也发现心肌细胞circSlc8a1过表达会增加死亡率，存活的小鼠也显示出DCM。此外，miR-133a的多个靶点在circSlc8a1过表达的心脏中上调。综上，作者的研究结果与circSlc8 sequester miR-133a机制一致。
虽然作者和当前其它学者的研究均未观察到circSlc8a1敲低的任何有害作用，但靶向这种高丰度的circRNA是否会引起任何副作用仍需要进一步研究。有研究发现，在心脏启动子控制下过表达miR133a的转基因小鼠在胚胎形成过程中出现心室间隔缺损和心肌细胞增殖减少导致的死亡现象，因此circSlc8a1抑制作用带来的后果还需要进一步思忖。虽然基于当前研究circSlc8a1和线性Slc8a1可能共享相似的转录控制机制，但是研究到底是什么调节心肌细胞中circSlc8a1的表达也是很有意义的。总之，作者的研究最终为将circSlc8a1抑制作为治疗心肌肥大的潜在手段提供了理论依据，探索这种治疗效果是否可以改善HF的进展的研究也将充满了实际意义。
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