如何提取出高质量RNA？一文带你“扫雷”
本文以植物为试材, 介绍二种常用的植物组织RNA的提取方法———试剂盒法和trizol法。
在提取RNA之前，准备工作是必须要进行的，这决定了RNA提取的成败与否。
一、仪器准备和消毒
首先是实验器具和仪器的清理和消毒，需要用到的器材和溶液有：研磨棒、研钵（有研磨仪的可不用研磨棒和研钵）、剪刀、镊子、钢珠、液氮、RNase free的离心管和圆底EP管、DEPC水（1ml DEPC加1000 ml无菌水）、DEPC处理水（DEPC水经湿热高温灭菌后的水）。将上述的金属制品和研磨棒、研钵先用0.5mol/L NaOH冲洗干净后放入DEPC水中浸泡过夜，用锡箔纸包住，以180°高温灭菌4 h，即完成准备工作。
二、取样
从植物取50mg-80mg样品，快速用DEPC处理水清洗表面，将灭菌后的剪刀和镊子将样品剪成小块加钢珠装入RNase free的圆底EP管中，放入液氮罐中以-80°保存预冷。
三、提取
首先介绍的是试剂盒法，试剂盒法是一种由专业试剂生产公司生产出来装有一整套RNA提取试剂的试剂盒子，有擎科、天根、TAKALA等众多牌子试剂盒，优点是简单快捷方便，对于小白来说易上手，缺点是成本高，此外试剂盒法主要针对大众样品，对于一些特殊样品效果可能一般。
从液氮罐中取出将装有样品的EP管放入已经预冷好的研磨仪中，快速研磨，如果用的是研钵，需要加入液氮充分研磨，研磨时间不能超过1分钟，样品磨成粉末后，按照试剂盒说明书添加试剂，即可完成RNA提取，用试剂盒提取，2小时即可完成一批RNA提取工作。
其次介绍的是Trizol法，Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性Trizol试剂操作上的允许同时处理多个的样品，Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染，缺点是需要自己配置试剂，比较繁琐。
试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2 O 配制）、DEPC H2O
提取步骤：
（1）组织样品按100mg加入1ml Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。
（2）加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
（3）4℃，12,000rpm 离心10 min，取上清。
（4）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3 min。（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）
（5）4℃ 12,000rpm离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。
（6）得到的水相溶液加入等体积异丙醇混匀，室温放置10 min。
（7）4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底，成胶状沉淀。
（8）按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。
（9）4℃ 10000rpm离心5min，尽量弃上清。
（10）室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。可用50ul DEPC H 2 O反复吹打溶解RNA样品。
四、质量检测：
提取出来的RNA需要进行质量浓度检测，以判断是否得到高质量的RNA，检测方式有两种，一种是电泳检测，一种是紫外分光光度计法。
（1）电泳检测法：分别取5 μL RNA 样品 加上1 μL 1xloadingBuffer上样缓冲液，在1%普通琼脂糖凝胶上电泳，电压 90 V，电泳 30 min 后在凝胶成像系统下观察RNA 带型。
一般高纯度的植物 RNA 电泳图谱中有 28S rRNA和18S rRNA两条特征性条带，28S rRNA 和 18S rRNA 条带内侧、条带上方和条带下方几乎没有弥散现象，且28S rRNA 条带宽度和亮度是18S rRNA 条带 2倍左右，两条条带明亮且一致，则表明提取的RNA没有降解，保持了完整性。
（2）紫外分光光度计法：根据核酸具有紫外吸收特征，还可选用超微量紫外分光光度计法测定波长在230nm、260nm 及280nm 下的光密度值，并计算 OD260/ OD280 及 OD260/OD230 的比值和RNA浓度。通常RNA浓 度需要≥100 ng/μL，OD260/ OD280比值在 1.8～2.0 范围之间，表明所提 RNA 质量较高，28S rRNA 和 18S rRNA 条带没有发生 明显降解， 若 OD260/ OD280 比值低于1.8 则说明存在蛋白质污染；而 OD260/ OD230 比值通常在 2.0～2.4 之间，表明所提 RNA 纯度较高，但对于植物 RNA 而言， 若 OD260/ OD230 比值低于2.0，则表明RNA有其他物质干扰，质量不纯。
五、保存
提取出来的RNA通常会有微量的RNase出现，随着时间的延长，会让RNA逐渐降解，因此需要尽快进行后续试验，如果试验未能及时进行，需要将RNA放入液氮中冷藏保存。
注意事项：
RNA提取是否成功的关键是RNase内外源性污染
1.在RNase外源性污染控制上，一是需要做到操作上需要经常更换手套，并且最好在超净台上操作；二是实验人员佩戴口罩，减少人员流动；三是自配试剂都必须用DEPC水配置，以防治外源性RNase污染。
2.在RNase内源性污染控制上，一是样品研磨需要-80℃预冷且快速研磨；二是要取适量的植物材料进行研磨，材料少会使 RNA 浓度低，材料多容易造成自身的 RNAse 过多而导致 mRNA 的降解， 还可能使材料研磨的不够充分，进而后续与溶液反应不彻底；三是所用的试剂都必须经过预冷；四是全程低温离心。
总结：
RNA的好坏直接影响分子分析的后续试验，高质量的RNA是进行转录组测序、RT-PCR等试验的基础，只要我们细心处理好每一个步骤，尽量减少污染，就能够提取出高质量的RNA。
END