科研 | Gut：原发性硬化性胆管炎胆汁微生物组的改变
编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种来源不明的胆汁淤积性肝病，其特征是胆管进行性纤维化狭窄和胆管粘膜溃疡性病变。PSC患者的死亡率增加，肝移植是唯一可用的治疗方法。然而，PSC的发病机理仍然不清楚。早有遗传学研究支持了PSC是一种自身免疫性疾病的假设，且多种研究表明PSC患者的粪便和粘膜的肠道微生物组发生了改变。因此，基于这多的证据以及目前的问题，研究人员招募了PSC以及健康的对照患者，要求患者在ERC之前的6个月内未接受任何抗生素治疗。分析65位患者显示，PSC患者的ERC适应症包括胆汁淤积或怀疑MRI占优势。在对照中，胆管造影和临床随访排除了PSC，且没有活检证实胆管增生或胆管癌的患者。随后进行胆汁酸微生物组的测序以及生物信息学分析。结果显示胆汁液中含有多种微生物，不同于口腔、十二指肠液和十二指肠黏膜群落。PSC患者和对照组之间的上消化道微生物组有所不同。但是，PSC患者与对照组之间在导管胆汁中的差异最大，包括生物多样性减少和病原菌肠屎肠球菌的增加。导管胆汁中肠球菌的丰度与有害的次级胆汁酸牛磺石胆酸的浓度密切相关。本研究表明PSC的特征是上消化道和胆管微生物组改变。胆汁性营养不良与促炎和潜在致癌物质牛磺石胆酸的浓度增加有关。
论文ID
原名：Alterations of the bile microbiomein primary sclerosing cholangitis
译名：原发性硬化性胆管炎胆汁微生物组的改变
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2019.6.6
通讯作者：Christoph Schramm
作者单位：汉堡埃彭多夫大学医学中心医学系＆马丁·蔡兹罕见病中心
实验设计
结果
1 导管胆汁液具有独特而多样的微生物组
首先检查了口腔，十二指肠液，十二指肠粘膜之间的微生物组结构差异。通过使用Bray-Curtis距离对主坐标进行约束分析来分析胆汁和胆汁液（图1A，B）。从十二指肠粘膜活检获得的微生物群落与其他部位分开聚集。虽然在这两个队列中，口腔和十二指肠液群落相似（p> 0.1），但在胆汁液微生物组与所有其他群落之间有明显的分离（分别为p≤0.01）。
接下来，在门类级别（最高分类层次级别）上探索了社区结构。在所有位点中，只有五个门实际上构成了整个微生物组，它们是放线菌，拟杆菌，硬毛，梭菌和变形杆菌。比较患有PSC的患者和对照组，发现口腔和十二指肠部位门的丰度没有显着差异（p> 0.05）。关于导管胆汁液，PSC患者与对照组相比，变形菌显示出明显增加（图1C）。PSC患者的其他胆道表现出与对照组相似的丰度（均为p> 0.1）。
由于健康胆汁液核心微生物组的基线结构尚不清楚，因此在分类学水平上研究对照组和PSC组的胆汁核心微生物谱。结果显示两组均包含以链球菌为主要属的多种核心微生物组（图1D）。然而，PSC患者显示核心微生物组的丰富度下降，这是由相对普遍度> 0.1％的属发生率降低所证明的。结果表明，在健康状态下，PSC与稳定的核心胆汁微生物组成存在偏差（图1D）。
图1 对照组和患者的口液，十二指肠液，十二指肠粘膜和胆汁液之间的β多样性
2 PSC中上消化道和胆管液微生物组的变化
比较PSC患者和不同身体部位的对照组之间的样本内多样性（α多样性）发现，与对照组相比，PSC患者的胆汁微生物群落平均α多样性降低（图2A）。在其他身体部位未观察到明显的α多样性差异，这表明PSC中的胆汁微生物组比其他测试的上消化道群落的改变更为严重。PSC患者与对照组比较显示，口腔，十二指肠液和胆管液之间的总体群落结构（β多样性）存在显着差异，图2B）和趋势十二指肠黏膜群落的差异（p = 0.064）。
图2 PSC患者与对照组之间的微生物组差异分析
3 PSC患者胆汁中病原体的扩展
首先研究了口腔，十二指肠液和十二指肠粘膜中的差异丰度模式。值得注意的是，在PSC患者的十二指肠黏膜活检中发现了大肠杆菌和韦荣球菌的明显过量表达。
与对照组相比，PSC患者的胆道社区在单一分类单元水平上表现出最大的差异（图2C）。肠球菌增加的最多，其次是葡萄球菌。在其他细菌中，奈瑟氏球菌在PSC患者中过多存在。关于胆汁液种类的差异丰度（图2C），粪肠球菌在PSC患者中的增幅最大，其次是韦荣球菌。
比较NGS获得的结果与PSC和对照患者的胆汁培养结果发现，阳性细菌胆汁培养率没有显着差异（阳性培养率分别为46％和47％；p> 0.1）。PSC患者显示胆汁液中经培养检测的已知病原细菌（肠球菌，克雷伯菌，阴沟肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌或葡萄球菌）比率增加的趋势。
4 先前的ERC对PSC中胆管细菌成分的影响较小。
首先以多变量方法研究了与总体生态指数的潜在关联，包括变量性别，体重指数（BMI），与PSC相关的结肠炎，胆红素，转氨酶，碱性磷酸酶（ALP）和白细胞水平的存在，以及通过瞬时弹性成像（TE），先前的细菌性胆管炎和先前的ERC。这些变量既没有通过使用跳算法的最佳子集选择（分别为p> 0.05）与α多样性显着相关，也没有通过逐步向前选择进行约束排序的显着的β多样性预测指标。
在上一节中，在PSC患者中发现的大多数单株细菌过表达，在有或没有既往ERC的PSC患者之间没有显示任何显着的差异丰度。但是，在PSC中过表达的细菌中，先前接受ERC的PSC患者中葡萄球菌和血链球菌过高。
5 PSC中胆汁液微生物组的代谢功能谱发生改变
在胆管液中检测的321条通路中，有52条表达发生了改变（表达不足34条，表达过度18条；图3A）。与降低的α多样性相对应，基本微生物组功能的大量丧失，例如“色氨酸代谢”或“氨基酸的生物合成”。几种潜在的致病细菌途径有所增加，包括“志贺氏菌病”，“沙门氏菌感染”和“致病性大肠杆菌感染”。
图3 微生物代谢途径的热图分析
6 与PSC中胆汁异位症相关的胆汁酸浓度和有害石胆酸水平的变化
对照中的胆汁酸相对浓度与文献中预期的一样，在PSC患者中几乎没有差异。正如治疗PSC的患者所期望的那样，PSC患者中熊去氧胆酸（UDCA）结合物的绝对浓度大大增加（p <0.0001）。大多数其他胆汁酸在PSC样品中显示出绝对浓度降低（均为p <0.05）。但是，牛磺酸胆甾醇（TLCA）是一种潜在的有害物质，是PSC患者和对照组之间唯一具有相似浓度的胆汁酸（p> 0.05，图3B）。
为排除UDCA治疗可以解释PSC患者绝对胆汁酸浓度降低的原因，进而分析了来自挪威奥斯陆PSC研究中心的20例未经UDCA治疗的PSC患者的独立队列中的胆汁胆汁酸谱。发现单一胆汁酸浓度降低的相同趋势，表明该观察结果至少部分与PSC病理生理本身有关。
随后，通过稀疏典范相关分析确定了使胆汁液微生物属丰度与胆汁酸浓度之间的相关性最大化的变量。接下来，测试了性别和胆汁酸之间的部分相关性，以调整性别，BMI，ALP和TE水平（图3C）。在肠球菌和TLCA之间观察到最强的相关性（p = 0.0021）。
因此，PSC增高最强的胆囊属肠球菌与有害的和可能致癌的胆汁酸TLCA升高有关。
讨论
先前关于PSC中胆道微生物组的研究中，发现胆道发育不良或胆管癌患者仅发生了微小的微生物变化，而无疾病并发症的患者与对照组相比几乎没有微生物差异。相反，本研究显示胆汁显着在没有发育异常或癌的特征明确的PSC患者中，微生物改变具有相当大的作用范围。最终的抗生素或ERC治疗后，应采用更完善的统计方法和控制良好的设计，并延长治疗时间，以促进取得明显的效果。此外，对来自近端上消化部位的微生物组进行额外测序，进而能够通过内窥镜途径控制胆汁液污染的影响，这可能是先前研究的不足之处。显然，发现胆汁微生物组与十二指肠粘膜或腔内微生物组，这表明在旨在解决胆道微生物组的研究中不能使用十二指肠液作为替代物。
PSC患者胆汁中兼性厌氧菌属变形菌的显着增加。包含许多已知人类病原体（例如肠杆菌科成员）的变形杆菌的异常繁殖通常与上皮供氧量增加有关，因此被认为是炎症，上皮功能障碍和疾病的标志。此外，PSC患者胆汁微生物组的平均生物多样性降低。从生态学的角度来看，生物多样性的下降是导致生态系统复原力丧失和生态系统功能良好的关键状态。
关于胆汁液培养的结果，PSC患者样本中检出的胆管炎病原体更为常见。这一趋势在16S rRNA基因水平上得到了证实，本研究在该水平上观察到了潜在病原菌的过度表达，例如肠球菌，普氏菌，葡萄球菌，劳森氏菌和皮肤杆菌。在这里，粪肠球菌在PSC患者中显示出最明显的增加。先前已证明肠球菌在PSC患者的粪便中含量更高。粪便大肠杆菌由于其基质金属蛋白酶的产生而与上皮屏障损伤和粘膜炎症有关。此外，粪肠球菌的胆汁分离株研究显示，PSE模型可诱导PSC患者外周血中T辅助型17型免疫反应。在最近的报道中，鸡肠杆菌是移入肠系膜淋巴结并驱动T辅助型17细胞介导的肝胆损伤的肠道病原体之一。
PSC患者十二指肠粘膜和胆管液中的韦荣球菌丰度增加。在先前对克罗恩氏病的研究中，这种病原体在PSC患者的粪便群落中被重复检测为超标病。克罗恩病是一种在临床表型上与PSC有显着重叠的疾病。与肠球菌属与手术切除和易患小儿患者穿透性并发症的复发性疾病风险增加相关。因此，后续应该研究肠道和球菌在小肠内和胆汁中潜在的功能和预后作用。
有趣的是，PSC患者的十二指肠粘膜表面大肠杆菌明显增加。在IBD中，粘膜粘附性大肠杆菌的患病率增加是公认的，在IBD中可引起粘膜损伤。此外，已证明大肠杆菌可产生半胱胺，半胱胺是最强的血管粘附蛋白（VAP）诱导剂。可溶性VAP-1水平升高与PSC患者的预后不良有关，因此，提供了大肠杆菌过度生长与PSC临床结果之间的联系。
细菌病原体的扩展反映在上消化道和胆汁微生物组功能谱的水平上，其中观察到侵袭性和促炎性细菌代谢能力的增加。在增加的微生物途径中，上皮细胞粘附和侵袭以及脂多糖的合成，脂多糖可能会导致PSC胆道上皮发炎。由于胆管粘膜是PSC炎症的主要部位，这些结果表明可能胆道微生物组改变对胆管细胞和胆管粘膜损伤的影响。此外，PSC胆汁液微生物组中广泛的功能丧失可能反映了有益微生物对胆管粘膜稳态的贡献下降。该结果可能与PSC中胆汁代谢组改变的最新发现有关。
通过检查胆汁酸谱，发现PSC患者的胆汁酸池减少，除了继发性胆汁酸TLCA。本研究的观察结果与先前报道的因PSC阻塞性胆汁淤积症患者胆汁酸浓度总体降低的报道有关，这种变化的原因尚不清楚，但胆汁酸的重吸收，停滞胆汁的合成减少和稀释是明显的解释，可能代表胆汁淤积性肝病的保护机制。这些结果在没有UDCA治疗的地理上分开的PSC队列中得到了验证。胆酸是一种有害的内生菌，与其结合物一起被认为是最有害的胆汁酸。有人提出，胆汁酸引起的胆管损伤是由更脆弱的胆管引起的，而不是由绝对过量的有害胆汁成分引起的。因此，生理性TLCA浓度可能已经对胆汁淤积和黏膜屏障受损的PSC患者造成了胆管损伤。有趣的是，TLSC水平与PSC样品中肠球菌的丰度高度相关。粪肠球菌比其他人类共生微生物具有更高的胆汁盐水解酶活性。胆汁盐水解酶催化将伯胆汁酸转化为仲胆汁酸的过程中去结合的关键步骤。因此，肠球菌的有害生物过量。可能与继发性胆汁酸水平有因果关系，对PSC患者具有促炎和致癌作用。以前，大剂量UDCA治疗导致PSC患者恶性肿瘤发病率增加和疾病进展与UDCA转化引起的石胆酸水平升高有关。因为肠球菌的丰度和TLCA浓度在异位患者中是异质的PSC，在后续研究中要解决的一个有趣的问题是，TLCA水平升高的患者是否代表处于不良后果（如胆管癌）风险的亚组。
在以前的报道中，没有证据表明UDCA对PSC患者的粪便微生物有影响。此外，通过16S rRNA基因测序获得的物种水平和功能信息不如采用shot弹枪宏基因组测序可靠整个DNA。但是，由于胆汁液中细菌DNA的丰度低于人DNA，因此无法在合理的测序深度对样品成功进行宏基因组nomic弹枪测序。微生物组分析仅限于种族，地理和饮食同质的单中心队列。未来的研究应通过纳入国际多中心队列并分析不同饮食的潜在影响来评估所观察到的变化的稳健性。虽然将PSC患者与其他慢性肝病患者之间的胆汁微生物组进行比较可能会加深对微生物改变对特定疾病的病理生理影响的理解。目前的结果表明，NGS方法超越了标准胆汁培养的限制，正如先前在众多人类和环境栖息地中所证明的那样。
讨论
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