综述 | Environmental Microbiology：生物膜复杂群落中种间的异质相互作用的研究技术
编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。
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近几十年来，微生物生物膜的重要性逐渐受到重视，当前的研究不仅仅局限于单一物种或双物种生物膜，正朝着研究多物种生物膜群落研究方向发展，对复杂群落的研究是理解自然生物膜生物学的一个必要条件，目前对于更高分辨率、更大信息量技术的需求正在日益增加。多物种研究面临的一个挑战是多样性和空间组织往往存在高度的空间、化学异质性，导致生物膜内部的功能异质性。目前在宏观尺度上以基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术为代表的许多方法有助于深入了解复杂群落的多样性和功能性。
另一个主要的挑战是如何准确地研究微生物胞外基质促进的空间异质性，包括细胞生理和化学浓度梯度的差异所带来的影响。此外，生物膜内部的微生物相互作用跨越物种边界，这些相互作用可能会影响生物膜的组成和功能。因此我们应当不仅局限于宏观尺度的分析，而要把重点放在微观尺度的相互作用上，这些相互作用可能是是调节群落功能的驱动力。
论文ID
原名：Unravelling interspecies interactions across heterogeneities in complex biofilm communities
译名：生物膜复杂群落中种间的异质相互作用（综述）
期刊：EnvironmentalMicrobiology
IF：5.147
发表时间：2019.10
通讯作者：Mette Burmølle
作者单位：丹麦哥本哈根大学生物系
主要内容
1 群落合成和模式系统的选择
通过研究复杂空间中的细菌群落，加深了对于新特性和相互作用的理解。在研究多物种生物模时，应考虑是否把群落视作一个整体，或评估单个微生物物种活动及特定功能。目前大多数研究者多使用遗传特性已知的模式生物来研究相互作用机制，然而在特殊生境中研究共分离菌株对于揭示自然群落中的相互作用和新特性至关重要。体外研究共生群落并不能较好的模拟自然环境，需注意实验中与自然环境之间可能会存在显著差异，作者认为制定评估细菌模式系统的基本框架至关重要，此外应区分基础和应用研究。对于基础研究而言，指出这些结果并不直接适用于所有环境，应当阐明环境变化如何影响相互作用。不同的生物膜模型将揭示不同的相互作用、空间组织以及对群落物种比例的影响，随着技术手段的不断发展，多物种群落中错综复杂的相互作用也在不断深入研究。
2 生物膜群落的空间组织
利用激光扫描共聚焦显微镜，使用紫外光或可见光激发荧光探针，研究在生物膜形成过程中单个物种的丰度和位置，洞察生物膜内不同物种的发育和空间组织。一些抗菌药物耐受性的实验结果表明，当受到胁迫时，群落内物种的组成和空间组织会影响整个群落的生存。荧光原位杂交技术（FISH）利用荧光标记的特异核酸探针来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，可研究低丰度关键物种在群落组成和组织中的重要作用，将特定物种的空间结构与功能联系起来。而CLASI–FISH技术，结合荧光原位杂交（FISH）的组合标记和广谱成像（CLASI）则可以研究更为复杂的群落互作机制，更好理解的对生物膜基本结构。
3 生物膜基质
多糖、蛋白质、DNA等胞外聚合物（EPS）与生物膜上细菌的新特性紧密相关，这些胞外聚合物在各个物种在生物膜中定殖发挥着关键作用，EPS的分布与特定物种的联系，对于解释异质性提供了更为详细的信息。目前还无法准确地确定这些EPS由哪些微生物产生，也无法确定这些EPS的最终功能。目前许多假定生物膜EPS基因已被鉴定，但是这些基因在基因组内部和基因组之间的存在异质表达及冗余性，使生物膜基质的分析变得更加复杂。生物膜EPS基因表达的调节也受到许多外部因素的影响（如营养物质的种类、类型、浓度、细胞密度、pH值），这些因素导致在整个生物膜中以及在不同条件下生长的生物膜之间形成不均匀的基质成分，进一步研究这些基质组分在建立生物膜群落中的具体作用及其相互作用尤为重要。
4 生物膜的宏观活性
转录组测序RNA-seq通过对总mRNA库进行测序来评估基因表达量，用于描述细菌对于环境刺激和变化条件的反应的功能，在生物膜转录组学研究中广泛应用。质谱技术，包括蛋白质组学、代谢组学和类脂组学，使人们能够在不同的条件下研究特定时间存在于同一个群落中的分子表达特征。然而当在宏观尺度、空间和理化异质性上进行研究时，这些数据就无法具体说明某些问题。质谱成像（IMS）可以获得具有精确空间信息的蛋白质组学和代谢组学数据，转座子测序（Tn-seq）用于精确测定和量化微生物基因组范围内的遗传相互作用。组学（omics）技术对于理解群落功能和相互作用非常有用，未来应进一步提高这些方法的特异性和分辨率，并将它们与其他技术结合使用，从而在特定范围内分析相互作用。
5 微米级的活性
细菌本身是极其微小的，因此研究其相互作用的尺度必须相应地调整，来了解群落过程构建的机制，这具有极大的挑战性。使用扫描电化学显微镜（SECM）以微米级的分辨率研究生物膜相互作用，使用表面探针可以定量地检测和绘制细菌在三维空间随时间变化而产生的氧化还原活性分子或带电分子。结合微传感器的微生物转录系统有助于研究理化异质性进而解释局部基因表达差异。光学相干层析成像（OCT）可用于生物膜的微观结构分析和生物膜的定量分析。既有技术和新兴技术的结合为研究者同时评估功能活动和空间结构带来了可能性。
6 单细胞活性分析
讨论
通过在实验室中对越来越复杂的生物膜合成模型中微生物群落进行研究，获得了越来越多的基于分子水平上的群落相互作用和内在群落特性的认知。此外，需要注意在不同尺度如宏观、微米或单细胞等尺度上，要考虑到由于高度的异质性，生物膜中的相互作用指出所研究的特定尺度或水平。由于目前定量、分析手段和成像技术的局限性以及许多实验设计的限制，为特定尺度选择正确的方法来平衡不同的尺度，并提供关于特定社区的足够信息，是一项具有挑战性的任务。
宏观尺度提供了总体多样性、空间组织和生产力的概述，可以成为许多研究的一个信息起点，因为它提供了“大局”，根据研究结果随后可以决定“放大”的位置。微尺度分辨率有助于区分单物种相互作用或种群动力学，揭示生物膜生物群落构建的驱动力，并进一步阐明潜在机制。而在单细胞水平上的分析是一项具有挑战性的工作，这一领域还有许多工作尚未开展，但为了从微生物水平上获得更多的生物膜相互作用的知识，单细胞分析势在必行。此外，在不同尺度上对生物膜基质微生物群落的洞察可以提供有关群落相互作用和功能特性的重要信息。作者认为，对生物膜研究中的异质性和尺度的认识是向前迈出的重要一步。将具有不同分辨率级别和在不同尺度上处理交互作用的技术结合起来将是最佳方法。此外，体外与自然环境之间的相关性和一致性问题至关重要。
合成微生物群落模型的最大优点是条件可以保持固定，而单一的、选定的参数是可调整的，这是理解和确定异质生物膜中群落相互作用的前提。但在具体研究当中需要根据具体的研究问题选择合理的实验设计和模型组合，以解决自然过程或生物技术应用，这对所使用模型的相关性以及我们开发、利用和集成新的可视化和分析方法的能力提出了很高的要求。进一步开展用来检测生物膜基质的新方法，深入揭示生物膜结构的重要组成部分，这在生物膜研究中仍然是一个相对悬而未决的领域。
未来的方法可能是比较来自环境样本的转录组学特征，进而验证模型，确定代表原生微生物群落结构多个模型中的最佳模型。这种方法可以弥合环境和合成多物种生物膜技术二者之间的鸿沟。
评论
通过在实验室中研究越来越复杂的合成微生物群落模型，我们获得了越来越多的关于分子水平上的相互作用和内在群落特性的信息，并且以宏观（多组学手段）、微米或单细胞尺度来研究群落特征尤为重要。作者认为，对生物膜异质性和尺度认识是学科向前发展迈出的重要一步，将具有不同分辨率级别和在不同尺度上处理交互作用的几种技术结合起来将是最佳方法。另外，特定环境微生物之间相关性和一致性问题至关重要，应当根据特定的研究问题选择实验设计和模型，以解决自然过程或生物技术应用问题。
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