科研 | Science Bulletin：量化根际微生物群落组装的扩增选择模型(国人作品)
编译：Echo，编辑：小菌菌、江舜尧。
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植物的生长离不开微生物类群的作用。其中，植物根系周围富集了丰富的微生物类群，不同微生物类群间的功能差异较大，如能使植物致病的病原菌，帮助植物获取水分或养分的菌根真菌、根瘤菌等，影响着根系的生长、对土壤养分的捕食以及环境适应性。根际微生物与植物相互作用，且植物对根际微生物具有一定的选择性。随着基因测序手段的更新与进步，科学家们对微生物组的研究更加深入。通过16S rRNA基因序列推断出的土壤样品中微生物类群相对丰度的研究表明，根际微生物群落是通过两步或多步筛选过程（two-step or multiple-step selection process）形成的：植物对分布于根外土壤，根际土壤及根内的微生物群落进行逐步的选择[1,3-5]。研究表明根际富集的细菌类群主要有：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）,而根际排斥的微生物类群为酸酐菌门（Acidobacteria）[5-9]。16S rRNA基因序的研究方法计算微生物相对丰度能够表示微生物群落的多样性及组成结构，但是相对丰度可能会掩盖微生物群落潜在的生态信息[10]，并不能反映出微生物群落的绝对丰富度。
本文基于微生物绝对丰度对根际微生物的筛选过程进行了研究与分析，以蒺藜苜蓿和水稻为供试材料，并提出了植物根际微生物群落“扩增-选择”组装的新模型。
论文ID
原名：An amplification-selection model for quantified rhizosphere microbiota assembly
译名：一种量化根际微生物群落的“扩增-选择”组装新模型
期刊：Science Bulletin
IF：6.227
发表时间：2020.03 .01
通讯作者：张学斌，于楠，王二涛
通讯作者单位：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
实验设计
为了克服传统测序中的局限性，我们采样了一种绝对量化的方法[10]，通过向样品中掺入嵌合嵌合细菌16S DNA来绝对定量土壤和根际隔间中的细菌16S rRNA基因 (Fig. S1 online)。对于每个操作生物分类单位（OTU），我们使用rrnDB数据库[12]估算16S rRNA基因拷贝数，然后采用用于定量肠道微生物组谱分析的方法[13]。随后，我们计算并评估（通过与单拷贝ropB基因比较）细菌类群的绝对丰度加权平均rRNA操纵子拷贝数（量化细菌丰度）(Figs. S1 and S2 online)。我们使用这种方法来量化根外土壤，根际土壤和根内微生物群落的绝对丰度。我们选择了两种植物作为试验材料：蒺藜苜蓿，其代表旱地土壤中生长的植物，以及水稻，一代表种在稻田中生长的植物（在生长季节被淹没在水中）
图S1 定量评估根际微生物绝对丰度的方法
结果
1 蒺藜苜蓿根微生物群的绝对定量
为了对蒺藜苜蓿根相关微生物群进行绝对定量，在DNA分离之前，将500 pg合成的穗状花序（约1.08亿个穗状副本）添加到100 mg土壤样品或50 mg根际和根部样品中。我们发现，每克根外土壤样品细菌16S rRNA基因数量为1.1×109，每克根际土壤样品中为1.51×1010，每克根样品的16S rRNA基因数量为3.28×109，根际土壤16S rRNA基因数量比根外土壤高13.7倍(Fig. S3a online)。我们对细菌类群的rRNA操纵子拷贝数进行加权计算后，根外土壤，根际土壤和根内细菌群落的丰度分别为6.91×108、6.44×109和1.24×109(Fig. 1a and Fig. S3b online)。这些结果表明，与大量土壤样品相比，根际中细菌群落的定量丰度大大提高。
先前的研究得出的结论是，根际沉积物和宿主细胞壁特征会促进根际中的有机营养细菌的生长[1]，因此我们预计只有少数快速生长的细菌会导致从根外土壤到根际的细菌总数增加。因此，我们评估了根外土壤，根际和根内样品中细菌的定量系统分布。我们发现，与根际土壤相比，主要菌门在根际土中的绝对丰度都显著，包括Alphaproteobacteria（α-变形杆菌）, Actinobacteria（放线菌）, Bacteroidetes（拟杆菌）, Gammaproteobacteria（伽玛变形杆菌）, Betaproteobacteria（贝塔变形杆菌）, Acidobacteria（酸杆菌）, Verrucomicrobia（疣状微生物），Chloroflexi（绿弯曲菌）等。从根外土壤到根际，细菌菌群的丰度增加范围为：芽单胞菌门扩增倍数最低，扩增了2.44倍，α-变形杆菌扩增倍数最高，扩增倍数为29.86倍。我们认为，这种根际微生物群落组装的不同模式与当前的微生物群落组装模型不同，可能是由于我们样品的独特或不寻常特征造成的。为了研究这种可能性，我们通过相同样品中相对16S rRNA基因的丰度重新分析了微生物群的富集模式。该分析表明，根际和根部内生区隔中的嗜酸性细菌，疣状微生物，绿弯曲菌和双歧杆菌的减少（图1b和1c；在线TableS3），与以前的研究结果一致[5-8]。因此，我们得出结论，在根际土壤中所有优势细菌门的绝对丰度都得到了放大。
我们进一步分析了在OTU水平上，根际中绝对丰度增加但被16SrRNA基因分析检测为相对耗竭的细菌类群(Fig. 1d―f; Table S4 online)。从土壤到根际，有170个（63.9％）OTU的丰度增加，尽管这些OTU的相对水平降低了(Fig. 1d―f)。有趣的是，我们注意到根际中丰度降低的OTU的测序深度非常低，这表明这种变化可能是由于稀有OTU测序不足所致。为了解决这种可能性，我们通过对与定量细菌丰度成正比的二次采样测序深度（即分别针对大块土壤，根际和根部样品分别读取1282、12880和2480个读数）来估计细菌的alpha多样性。结果表明，无论使用定量细菌图谱还是相对细菌图谱，由Shannon和Invsimpson多样性指数估算的细菌α多样性在根际土壤中最高，其次是根外土壤，在根内样品中最低(Fig. S5a online)。但是，如果忽略了根外土壤和根际中定量细菌丰度的变化(即将所有根外土壤，根际和根内样品稀化至20000个reads)，则细菌α多样性在根外土壤中最高，其次是根际，在根样品中最低(Fig. S5b online)。
总体而言，我们的数据表明，根际土壤中大多数细菌类群的丰度增加，这与基于使用相对OTU丰度的结论不同。根部内生细菌群落的绝对定量显示，Alphaproteobacteria，Bacteroidetes，Betaproteobacteria，Firmicutes和Deltaproteobacteria升高(Fig. 1a and 1b;Table S3 online)，但相对丰度方法未检测到。根内生细菌群落被认为是根际内生细菌群落的一个子集，其中细菌群落直接接近根。我们的绝对定量显示，根际到根部的绝对丰度最大的细菌类群是放线菌（63％），γ-变形杆菌（59％）和Delta变形细菌（59％）(Fig. S4b online)，表明这三个门系最易吸引到苜蓿根。总之，我们对微生物群的绝对定量揭示了一个微生物组集合，相比于土壤，在根际中所有优势细菌菌群都被扩增，然后在根中选择细菌菌群(Fig. 1h)。
2 水稻根际区微生物群落形成过程：扩增和选择
为了测试在苜蓿中观察到的根微生物群装配的趋势是否是植物中微生物群的一般特征，我们定量了在类似水稻土条件下种植的水稻中的微生物群落。在水稻的根际中，我们发现优势菌种，硬毛菌，放线菌，蓝细菌，酸性菌，拟杆菌，拟杆菌和变形杆菌，与根外土壤相比，它们的丰富度都升高了(Fig. S6 online)。在水生境中高度丰富并且具有一些光合成员的Chloroflexi bacteria（绿曲菌门）没有改变（补充材料图S6b和S6e），这表明Chloroflexi bacteria是自由生活的并且独立于植物宿主而生长。微生物的绝对定量显示了Firmicutes（纤毛虫）, Actinobacteria（放线菌）和 Acidobacteri（嗜酸菌）升高，而使用相对丰度法则可以忽略不计，并将其归类为枯竭类群(Fig. S6 online)。
总而言之，我们对蒺藜苜蓿和水稻的研究表明，在根际中细菌类群的扩增模式是根微生物群落形成的一般特征，并且可能受到根际的促进（例如植物根际中的营养因子）(Fig. 1h)。
图1：绝对定量苜蓿根际微生物群落揭示植物根际微生物群落“扩增-选择”组装模型
讨论
根微生物群对于自然生态系统中的养分和碳循环至关重要。本研究中，我们介绍了绝对定量方法和相对丰度方法的比较，以评估根微生物群。当使用16S rRNA基因的相对丰度时，我们的结果与以前的研究相似，我们确定了根际中的系统水平富集与拟南芥，水稻和其他植物物种中报道一致。相反，当定量细菌的绝对丰度时，我们发现相对于根外土壤，所有优势细菌门都在根际中被扩增。据报道，植物固定的光合产物总量中有10-30％分泌到根际，这表明植物根系分泌物能够“喂养”土壤微生物。我们把缺乏营养的根外土壤比作“乡村”，根际比作是“大都市”，微生物群落可以在“大都市”找到更多的机会，进行扩增和繁殖。根际微生物的扩增先于根系对微生物的选择。根际中不同门菌群的扩增可能反映了对养分利用率的提高，而细菌类群的扩增偏差可能取决于养分利用效率，生长速率，微生物与微生物之间的相互作用等因素，所有这些因素均可能受到宿主基因型的影响。值得注意的是，在比较土壤和根样品的定量结果时，应考虑土壤和根的不同特性。基于我们量化的根微生物群装配体，对于未来通过根际微生物组工程改造提高农业可持续性的方法，至关重要的是在田间植物整个生命周期中定量跟踪根际微生物组的变化，并将微生物组负荷与定量特征联系起来例如无法使用相对丰度方法解决的植物生理参数。
评论
该研究通过一种计算微生物绝对丰度的方法，比较了根外土壤、根际土壤及根内微生物的16S rRNA基因数扩增的差异性，阐明了根际微生物群落组装的新模型——“扩增-选择”，该模型表明细菌主要菌门在根际土中被显著扩增后被根系进一步筛选，形成特异的根内微生物类群。本文的研究结果有助于人们进一步的认识根外、根际、根内微生物的形成机制，对后续的研究提供极具意义的参考。
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