科研 | Environmental Microbiology：森林树种通过影响土壤硝化细菌菌群对土壤硝化作用产生生物抑制效果
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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一些温带树种与土壤的低硝化速率有关，由于其具有抑制生物硝化作用的潜力(BNI)，因此这些树种对森林氮循环具有重要意义。但有关在森林生态系统中BNI的研究较少，且目前尚未鉴定出由BNI树种控制的硝化物类群。本研究中，我们通过给出BNI的直接证据以及鉴定受影响的硝化物类群两种方式，评估了一些树种如何调控土壤硝化作用。
① 通过比较28年生的几个单一栽培树种发现，硝化速率与亚硝酸氧化菌Nitrobacter的丰度有很强的相关性(树种间的变化是50-1000倍)，而与氨氧化古菌(AOA)的丰度仅表现出微弱的相关性。
② 采用低硝化作用采样点和高硝化作用采样点之间的土芯相互移植之后，我们证明了硝化作用在移植16个月后发生了变化，并且与Nitrobacter丰度的变化有关。
③Picea abies和Abies nordmanniana的凋落物或土壤提取物对Nitrobacter hamburgensis X14的生长有抑制作用。我们的结果首次提供了具有BNI能力的树种直接影响Nitrobacter丰度的直接证据。
论文ID
原名：Biological inhibition of soil nitrification by forest tree species affects Nitrobacter populations
译名：森林树种通过影响土壤硝化细菌菌群对土壤硝化作用产生生物抑制效果
期刊：Environmental Microbiology
IF：5.147
发表时间：2019.3
通讯作者：Le Roux
作者单位：里昂大学
实验设计
实验样本采集
本研究样本采集自坐落于Breuil-Chenue的由INRA长期实验管理的森林生态系统。在6个随机选择的地块中的每个地块采集6个土芯（0-10 cm深，8cm宽），对36个土样样本过4mm筛，手动去除可见根系。一部分土壤样品4°C储存4天内，随后测定pH、电位和净硝化速率等。另一部分样品存放在-20°C储存用于分子层面分析。
假说提出
本研究评估了不同的温带森林树种如何通过三步法生物控制土壤硝化活性（图1）。首先，我们比较了28年生单一轮作树种(5个树种)和原始林土壤中硝化菌(AOB、AOA、Nitrospira、Nitrobacter、Comammox A以及Comammox B)的酶活性和丰度，以及环境条件(水分、矿质氮浓度和pH)。我们假设AOA和Nitrospira的丰度与这些土壤中的硝化速率相关，同时Commamox可能在硝化作用中起着重要作用。其次，我们通过土壤土芯移植的方法，探究了移栽16个月和28个月后土壤中硝化菌活性和丰度变化的动力学变化。我们假设，从假定的BNI树种移植到非BNI树种的土芯后可能会发生抑制效果，从而导致硝化菌丰度和活性的增加。第三，为了探究低硝化速率是否是由于特定植物次生代谢产物的产生，我们将BNI树种的凋落物或土壤提取物与从硝化菌组中选择的对BNI最敏感的菌株进行培养，以更直接地探究与土壤低硝化速率相关的树种的实际BNI能力。
图1 本研究中用于分析树种如何控制土壤硝化活性和丰度的三个步骤的示意图。
结果
1 在28年生地块中硝化作用与硝化细菌丰度之间的关系
在28年生的样地中，净硝化作用和硝化酶活性(NEA，如潜在的硝化作用)之间呈强正相关关系(R2=0.9，p=0.039)。土壤硝化作用在不同树种间差异很大，P. nigra，P. menziesii以及F.sylvatica的土壤硝化作用最高值约0.05 µg-N h-1g-1左右，而P. abies、A. nordmanniana以及原生林的土壤硝化作用的值低于0.01 µg-N h-1g-1(图2)。土壤硝化作用与土壤pH之间的关系并未表现出相关性关系。对于3个硝化作用较低的样点(L)，净矿化作用远高于净硝化作用，即尽管存在NH4+的有效性，但硝化作用仍然很低。然而3个硝化作用较高样点(H)中的2个，净硝化作用与净矿化作用相似，即形成的NH4+全部转化为NO3-。
所有样点之间硝化酶活性（NEA）之间具有显著性差异并且与土壤AOA和Nitrobacter的丰度变化呈显著正相关(p=0.0113，R2=0.83；p=0.0009，R2=0.95。图2)。然而，Nitrobacter丰度的差异特别大(在NEA最低的地块其丰度为从103 nsrAcopies g-1土壤，而在NEA最高的地块其丰度高达6*105 nsrA copies g-1土壤)，并且NEA与Nitrobacter丰度之间的表现出很强的相关性。相比之下，AOA丰度在不同样地之间没有显著变化(从6*105到106个amoA copies g-1土壤)。AOB、Nitrospira或Comammox的丰度与NEA之间没有明显的相关性(图2)。
2 土壤土芯移植后硝化作用的变化与AOA和Nitrobacter丰度变化的关系
在土芯移植16个月后，将高硝化作用样地(H)的土芯移植到低硝化作用样地(L)的土芯中，即HL处理，该处理下的净硝化作用与HH土芯中的硝化作用没有区别(图3)。相反，LH土芯的净硝化作用显著高于LL土芯(图3)。然而，LH处理的硝化作用仍然低于HH处理。土芯移植28个月后，HL土芯的净硝化作用显著低于HH芯，但仍高于LL芯的硝化作用(图3)。LH土芯的净硝化作用远高于LL芯，与HH芯的硝化作用无显著差异。
土芯移植16个月后，硝化作用与Nitrobacter丰度呈显著的正相关关系，但与AOA丰度呈弱的相关性关系(p<0.0001，R2=0.80；p=0.046，R2=0.34；图4)。其中，在LH处理下观察到的硝化作用的增加与Nitrobacter丰度的增加密切相关，而AOA的丰度并没有增加(图4)。28个月后，硝化作用与AOA和Nitrobacter的丰度均表现出很好的相关性关系(p=0.0006，R2=0.71，p=0.0002，R2=0.78；图4)。
3 低硝化作用的土壤和凋落物提取物对模型硝化杆菌菌株生长的影响
低硝化作用的P. abies和A. nordmanniana样点的土壤和凋落物提取物降低了亚硝酸盐氧化菌株Nitrobacter hamburgensis X14的生长(图5)。这种生长抑制与提取物类型(即凋落物或根系分泌物)密切相关(p<0.001)，而与提取物浓度并无相关性关系(p=0.032)。从A.nordmanniana采样点凋落物中提取到的提取物使N. hamburgensis的生长减少约12%，而不受提取物浓度的任何影响(图5，右)。从A. nordmanniana采样点土壤中提取的提取物分别使N. hamburgensis的生长下降约16%（最低浓度条件下）和26%（最高浓度条件下）(图5，右)。来自P. abies样地的凋落物提取物和土壤提取物分别使N. hamburgensis的生长降低了25%到31%，同样未表现出任何明显的提取物浓度效应(图5，左)。
讨论
1 在土龄较老的土壤中，树种对土壤硝化作用的影响主要与Nitrobacter丰度的变化有关
正如以前报道的那样，森林树种对土壤硝化作用有很大的影响。从长远来看，本研究中，P. abies，A. nordmanniana和原生林的潜在硝化速率和净硝化速率比P. nigra，P. menziesii以及F. sylvatica的相关速率低10-1000倍。通过在每个采样点采集的几个土芯足以描述整个采样点的变异程度，通过研究发现高硝化作用采样点与低硝化作用采样点在硝化活性和丰度上的差异大于不同采样点组内的差异。这可能是因为在森林生态系统中，一个土壤土芯包括来自几个树种个体的根，这与较大的水平根延伸有关。本研究中，我们证明了这些不同的硝化速率与特定的氨氧化和亚硝酸氧化基团的大小相关。硝化速率与AOB的丰度并不相关。相反，所研究的森林土壤中的硝化速率与AOA的丰度显著相关，这与其他研究相一致，由于AOA比AOB更能适应低氮底物有效性和低pH条件（森林土壤常见的生境），因此AOA可能是森林土壤硝化作用的主要参与者。然而，供试土壤中AOA和AOB的丰度相似，平均分别为5.77*105和5.58*105copies g-1干土。这一发现与其他研究（森林土壤中AOA含量高于AOB含量）形成鲜明对比。此外，尽管AOA和AOB的丰度都很高，但仍观察到较低的硝化速率，而且较高的氨化速率与在高硝化地块中观察到的相似，且不能用土壤pH值来解释。所有的这些结果都不符合树种对硝化作用的影响，因此，这种影响可能主要是通过影响氨氧化、pH或氮的有效性来实现的。
尽管与Nitrobacter相比，Nitrospira的丰度更高，但在28年生林地土壤中的硝化速率与Nitrobacter的丰度表现出很强的相关性，而与Nitrospira的丰度无关。类似地，有研究表明，尽管农业土壤和草原土壤中的Nitrospira丰度较高，但硝化速率主要与Nitrobacter丰度有关。因此，尽管在森林土壤中Nitrospira的丰度经常高于Nitrobacter，但我们的结果表明Nitrobacter在硝化作用中可能有更突出的作用。这意味着在没有硝化作用的地块中，仍然可以观察到高丰度的AOA、AOB和Nitrospir，以及高的矿化率，而只有Nitrobacter的丰度明显减少。尽管有研究发现，在酸性和基质受限的环境中，Comammox生物可能比其他硝化细菌群更具竞争力。但有关于Coammox在森林生态系统中对硝化作用的实际作用的了解却很少。在本研究中，硝化速率与Comammox clade A和Comammox clade B的丰度都不相关。
由于氨氧化通常被认为是硝化的限速步骤，过去的大多数研究都集中在氨氧化菌以更好地了解硝化速率的变化，而忽略了亚硝酸氧化菌可能的重要性。因此，有关NOB对森林生态系统硝化速率的重要性的信息很少。传统上，由于NO2-的可用性将是这些群体之间生态位划分的主要驱动力，AOB和Nitrobacter在高N可用性下受到青睐。本研究中，我们没有观察到Nitrobacter丰度与AOB或AOA之间有很强的相关性，同样也没有观察到Nitrobacter丰度与矿化率之间的关系。这些结果有力地表明：
(I)Nitrobacter是限制低硝化作用土壤中硝化速率的主要硝化菌群，
(II)土壤氮素有效性和pH不是Nitrobacter丰度的主要驱动因素，从而也不是硝化作用的主要驱动因素。
2 土壤土芯移植后硝化菌活性和丰度的动态进一步表明，树木通过Nitrobacter而不是AOA调控硝化作用
土壤土芯的相互移植已经被用来研究非生物和生物驱动因素对硝化菌的影响。本研究中，对不同林木树种间的土芯进行移植可以更好地识别对树种影响最敏感的硝化菌群。假设硝化的第一步是公认的限制步骤，而AOA是这些森林土壤中硝化的主要功能因子，我们预计，将低硝化采样点(L)的土芯移植到高硝化采样点(H)的土芯（即LH处理），首先会导致AOA丰度增加，随后由于其底物可用性的增加，使NOB的丰度增加。出乎意料的是，我们的结果显示，在16个月后，LH处理首先导致了Nitrobacter丰度的增加，同时观察到硝化作用有所增加，但AOA的丰度没有变化。仅在LH处理移植后28个月，AOA的丰度观察到增加的趋势。总体而言，16个月后，硝化速率与Nitrobacter的丰度有很强的相关性，但与AOA丰度关系不大。这有力地表明，在低硝化采样点(L)，Nitrobacter而不是AOA是限制硝化作用的主要硝化菌群，而在低硝化采样点中（L），其低Nitrobacter丰度的驱动因素在高硝化采样点（H）中迅速释放。有趣的是，从H到L的土芯移植对硝化活性、Nitrobacter和AOA丰度的响应比LH处理要低的多，其中仅在HL移植28个月后，观察到潜在硝化作用的降低。考虑到在土芯移植实验时切断了树根，该的结果可能是由于根部对Nitrobacter有很强的生物控制作用。
3 有证据表明某些树种能抑制Nitrobacter
低pH和低N有效性是大多数森林、heathland和湿润的草原生态系统的典型特征，它们所选择的植物具有不同的提高土壤N有效性的机制。特别是，已有研究发现，这些生态系统中的一些植物物种可以抑制硝化菌，这种抑制作用通常是由于根系分泌的特定化合物的产生。然而，目前被鉴定为具有生物硝化抑制(BNI)能力的植物大多数是草本植物。此外，以前的研究所报道的这些种类对氨氧化菌的抑制作用，通常是指对AOB的抑制作用。因此，我们不能排除氨氧化菌种群受到了BNI的影响，因为大多数硝化抑制剂都是抑菌的，而不是杀菌的。本研究首次证明了树种诱导抑制Nitrobacter的BNI能力。本研究结果表明，spruce和Nordmann fir的土壤和凋落物提取物有效地抑制了NOB菌株N.hamburgensis的生长。与Nordmann fir土壤提取物共培养后观察到较高的抑制作用，表明这种树种可能主要通过根系分泌物来控制Nitrobacter的丰度和硝化速率。相反，spruce样地土壤和枯枝落叶提取物都是具有BNI作用的化合物的来源。因此，与原位较低的硝化速率相关的树种对Nitrobacter表现出抑制作用，这也解释了土芯移植试验的结果。由于NO2-的积累可能导致植物、动物和微生物的毒性，改变代谢途径（如硝化-反硝化过程、古菌好氧nirK-反硝化过程、通过NO2-转化产生亚硝酸），从而解释了NO2-积累的不足。
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