科研 | Gastroenterology: “共生”可改变非酒精性脂肪肝患者粪便微生物群，但不改变肝脏脂肪或纤维化
编译：陈康，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景与目的：肠道菌群失调与非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）有关。我们调查了益生菌与益生元相组合的合生元是否影响肝脏脂肪含量，NAFLD患者的肝纤维化以及粪便微生物组的组成。
方法：我们在英国对104例NAFLD患者进行了一项双盲2期试验。参加者（平均年龄，50.8±12.6岁；男性为65％；37％为糖尿病患者）随机分配给定合生元药物（低聚果糖，4g两次每天，加上Bifidobacterium animalis subs. Lacits BB-12;n = 55）或安慰剂（n = 49）持续10-14个月。在研究的开始和结束时，通过核磁共振光谱法（MRS）测量肝脏脂肪含量，肝纤维化是由经过验证的生物标志物评分系统以及振动控制的瞬态弹性成像来确定。分别在研究的开始和结束收集粪便样本，并通过16S rDNA测序分析了粪便微生物群。
结果：在实验开始（基线）和研究结束时，合生元组的脂肪含量百分比值分别为32.3％±24.8％和28.5％±20.1％；安慰剂组为31.3％±22％和25.2％±17.2％。在未经参数校准的情况下，我们没有发现肝脏脂肪在两组中有显著差异（β= 2.8；95％CI，-2.2至7.8； P = 0.30）。在参数校准后的回归模型中（针对基准肝脏脂肪加上年龄，性别，体重差异和基线体重），仅体重的减轻与肝脏脂肪减少有关（β= 2； 95％CI，1.5-2.6；P = 0.03）。接受合生元干预的患者的粪便样本中与基线相比，粪便的Bifidobacterium 和Faecalibacterium的丰度上升，以及Oscillibacter和Alistipes丰度的减少；安慰剂组未观察到这些变化。粪便微生物群的组成变化与肝脏脂肪含量或肝脏纤维化无关。
结论：在一项针对NAFLD患者的随机试验中，1年内给予合生元干预（益生菌和益生元）改变了粪便微生物群，但没有改善肝脏脂肪含量或肝纤维化。
论文ID
原名：Synbiotic Alters Fecal Microbiomes, but not Liver Fat or Fibrosis, in a Randomized Trial of Patients With Non-alcoholic Fatty Liver Disease
译名：在一项针对非酒精性脂肪肝患者的随机试验中，“共生”改变了粪便微生物群，但不改变肝脏脂肪或纤维化
期刊：Gastroenterology
IF：19.233
发表时间：2020.1.25
通讯作者：Eleonora Scorletti
作者单位：Faculty of Medicine, University of Southampton and Division of Gastroenterology, University of Pennsylvania
实验设计
104名已证明NAFLD的参与者被随机分配至合生元干预组或安慰剂组，实验期为最少10个月，最多14个月（图1）。对于实验期间抗生素的使用我们有规定以便实验结果准确，实验干预期最多允许患者进行两个疗程的抗生素服用，在实验测量前的一个月不允许有抗生素的服用。55名参与者被随机分配接受合生元治疗，合生元包括果糖寡糖，聚合度<10，每袋4 g，每天两次（两袋一天，放入冷饮中搅拌服用）再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天服用至少100亿个CFU（每天1个胶囊），有49名参与者随机接受安慰剂，每天两次服用4克麦芽糖糊精（每天1粒胶囊每天加两小包，搅拌成冷饮）。
结果
104个参与者中有89个完成了整个干预阶段（58个男性，31个女性）表1显示了，在基线上，合生元组和安慰剂组之间的肝脏指标，双歧杆菌丰度以及主要临床和生化参数没有差异。表2显示了基线与实验结束时之间一些生理生化指标的变化。在基线水平上，肠通透性测量（乳果糖/甘露醇）为：中位数= 0.11，四分位间距（IQR）= 0.25；平均值±标准差0.27±0.4（表2）。由于实验设计对象不是健康的对照组，我们将基线乳果糖/甘露醇比率与健康受试者的比率进行了比较。值得注意的是，乳果糖/甘露醇比的平均值和中值比健康受试者大10倍，说明在NAFLD患者中肠道通透性改变。我们发现在合生元干预组和安慰剂组中在基线和实验结束时肠道通透性都没有变化。有趣的是，89位患者完成了实验后，通过MRS测量的肝脏脂肪含量总体减少了65％。关于LPS，在安慰剂组（p = 0.80）或治疗组（p = 0.40）中基线与实验终点之间都没有差异。合生元的治疗未影响LPS在血清的水平。在研究结束时，肝脏脂肪变化与LPS变化之间的没有关联（p = 0.80）。我们使用一个回归模型来观察合生元对粪便SCFA的影响，这个模型归纳了各个SCFA的差异，年龄，性别，组别以及基线的SCFA水平。我们发现合生元并未对SCFA产生影响（总SCFAp = 0.21；乙酸p = 0.23;丙酸p = 0.24;丁酸p = 0.40）。关于肝脏脂肪含量，我们采用肝脏脂肪含量差异作为回归模型结果变量，对性别，年龄，体重差，基线体重，在基线的肝脏脂肪含量和SCFA的差异进行校准。我们发现SCFA的变化与肝脏脂肪百分比的变化没有关系：SCFAs = 0.63；乙酸p = 0.62;丙酸p = 0.78；丁酸p = 0.73。
表3展示了基线水平和实验结束时的主要数据以及多元线性回归模型。在合生元干预组，肝脏脂肪减少4% (p=0.08)，Bifidobacterium显著增加(p<0.001)。合生元对肝脏脂肪减少没有显著的作用。在安慰剂组，肝脏脂肪显著减少6%(p=0.01)，Bifidobacterium没有变化(p=0.5)。在未进行参数校准的分析中，肝脏脂肪变化在两组之间不显著(β=2.8; 95%CI:-2.2, 7.8;p=0.3），在性别，年龄，体重差别，体重的基线水平，肝脏脂肪含量的基线水平进行参数校准后，合生元和安慰剂组刚好到达显著水平(β=4.1; 95%CI:-0.02, 8.3; p=0.05)。
在多变量回归模型中，体重减少是与肝脏脂肪显著减少的唯一相关因素每公斤体重减轻与肝脏脂肪减少2％有相关性（β= 2.0; 95％CI：1.5，2.6; p = 0.03）（表3）。我们然后以肝脏脂肪差异作为结果变量进行回归建模，体重变化（这里是体重减少）作为解释变量。数据表明体重减少是与肝脏脂肪显着减少密切相关（β= 1.9； 95％CI 1.4, 2.5；p ＜0.001）。我们使用了2个肝脏纤维化评分模型（即ELF和NAFLD纤维化评分），我们采用了与肝脏脂肪相同的回归模型校准了纤维化得分的基线结果以及年龄，性别，体重差异和基线体重。我们没有发现肝纤维化评分与合生元治疗相关（表3）。我们还测试了肝脏的硬度测量值（kPa）对合生元干预的反应（由VCTE评估）。在包含基线和实验结束时的肝硬度数据差值作为结果变量的回归模型中，对肝硬度基线测量值以及年龄，性别，体重差异和基线体重进行参数调整后，发现合生元与肝硬度的变化无关（B系数= -0.78（95％CI -1.93，0.37），p = 0.18）。因此，这些数据表明，合生元不太可能影响肝脏脂肪或肝纤维化。体重减轻与肝脏纤维化和肝硬度改善有关：ELF（p = 0.039）和NAFLD纤维化评分（p = 0.027）（表3），以及肝硬度值（p = 0.025）有关。有趣的是，在合生元组内，发现Bifidobacteriumspp.丰度的变化与肝脏脂肪的变化有负相关（Spearman rho =-0.36，p = 0.017）。但是，在对体重变化，年龄和性别进行参数调整之后，不再有关联了（Spearman的rho = -0.10，p = 0.51）。我们还测试了Bifidobacteriumspp.丰度的变化与研究结束时主要实验结果的关联，值得注意的是，我们没有发现研究结束时Bifidobacteriumspp.丰度的变化和肝脏脂肪变化以及纤维化评分有关联。而且，体重变化与合生元治疗以及Bifidobacteriumspp. 丰度的变化之间没有关联。在一个使用Bifidobacteriumspp.丰度的变化作为结果变量的多变量回归模型中，对分组，年龄，研究结束时的性别和体重差异进行参数调整后，体重差异，年龄和性别与双Bifidobacteriumspp.丰度变化无明显关联。
在基线时，两组之间的粪便微生物组无差异。（表S4，表S5，图S1），Sphingomonas 和 Sutterella与肝纤维化评分之间的有正相关，而Olsenella与MRS测量的肝脏脂肪之间有负相关。Clostridia和 Firmicutes与肝纤维化得分有负相关（表4）。总细菌含量不受合生元干预的影响（图S2）。合生元治疗与减少个体内微生物丰富度多样性（α-多样性）有正相关（richness level），但在均匀度水平（evenness level）或均匀度和丰富度水平（evenness and richness levels）（表S4）上没有关系，合生元可能与低丰度的菌种的消失有关。从β多样性指数Morisita-Horn可以看到微生物群落之间的差异（图2A，主坐标分析）。观察到的β多样性分布主要是由于个体间的差异（解释了总变化的86％，ANOSIM，1000 permutationtest，p = 0.001）。为了评估合生元治疗与安慰剂治疗相比是否对微生物群结构有更大影响，我们比较了来自同一个个体的每一对样本（基线和研究结束，通过β多样性指数计算）（图2B）。合生元组显示出比安慰剂组更高的β多样性值，表明合生素治疗对肠道菌群的影响更大。当观察其他β-多样性时，如Binary-Jaccard和Bray-Curtis获得了相似的结果（图2B）。按照这些观察结果，与安慰剂相比，合生元治疗促进了Bifidobacterium 和Faecalibacterium 减少了 Oscillibacter 和 Alistipes（图3，表S6），在其上一级分类中也有显著意义。在门级（图S3）或任何其他分类上都没有显著意义（表S7，图S4）。通常与炎症，肥胖和NAFLD有关的细菌没有变化（图S5）。令人惊讶的是，只有Oscillibacter 在分析调整模型后，与MRS测得的肝脏脂肪有负相关（β=-2.2; 95％CI：-4.3，-0.1； p = 0.04）。Bifidobacterium spp.增加了2.2倍，也通过qPCR确认了这一点（图S2）。
讨论
我们的研究是第一个测试长达12个月合生元治疗疗效的研究。我们测定了肝脏脂肪含量，NAFLD的纤维化评分（ELF和NAFLD纤维化评分），肝硬度测量，和肠道菌群的变化。在实验结束时，我们没有发现合生素和安慰剂组之间任何肝脏脂肪含量，纤维化评分和肝硬度测量值的差异。
我们发现了65％的参与者的肝脏脂肪总体减少仅与体重减少有关，从非标准化的β系数来看，体重减轻1 kg，肝脏脂肪百分比减少2％。体重减轻也与ELF和NAFLD纤维化评分和肝硬度的改善有关。大多数患者的肝脏脂肪含量均有改善，我们猜测与“临床效应”有关，即参与者将从参与临床试验中受益。在参与试验期间我们给予了健康生活的指导。我们发现合生元组中肠道菌群的变化，并且合生元治疗后显著改变了肠道菌群的多样性。Bifidobacterium 和Faecalibacterium的增加和Oscillibacter和Alistipes的减少。Bifidobacterium是已知对脂质代谢和肠屏障有一些有益的作用。但是，我们找不到Bifidobacterium与肝脏脂肪变化（在调整了体重减轻之后）或肠道（调整年龄，性别和肠道基线测量值后的通透性渗透性（乳果糖/甘露醇比））上的变化有关。
据报道，抗炎细菌Faecalibacterium prausnitzii在NAFLD中降低，且不依赖于肥胖和胰岛素抵抗，并且在摄入菊粉型果聚糖后会增加。Faecalibacterium prausnitzii也显示与在肝脏门管区（portal tract）的淋巴细胞和Kupffer cells标志物有负相关。相反，Alistipes spp已显示与肝炎和氧化应激正相关因此，我们可以推测Faecalibacteriumprausnitzii的增加Alistipes spp减少与合生素治疗相关，可能会减轻炎症。特别是，通常与炎症，肥胖和NAFLD的细菌均未受到影响（图S5）。Raman等人的最新研究，将NAFLD肥胖患者的粪便微生物群与健康对照组进行了比较。这些作者表明，NAFLD患者的Oscillibacter明显低于健康对照。因为我们这个研究没有健康对照，所以我们与其他研究做了对比，对比发现Proteobacteria在NAFLD患者中高于健康人群2倍。
在这个研究中，我们选择Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12作为益生菌是因为它对宿主有益处以及有很好的定殖能力。聚合度小于10的果寡糖的选择是基于其能够刺激Bifidobacteria的增殖。与菊粉相比，果寡糖对我们的Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12益生菌很较强的亲和力，并改善其在宿主中的存活和生长。此外，我们还研究了使用经过验证的体外粪便细菌培养系统来模拟病情，Bifidobacterium animalissubsp. lactis BB-12以及果寡糖在体外对人类肠道菌群的作用，表明，使用合生元或益生元与单独的益生菌或阴性对照相比，细菌总数和bifidobacteria总数显着增加，此外，合生元补充剂耐受良好。
在试验期间，仅一名患者经历了一些肠胃不适症状（腹胀和肠胃气胀）。我们建议该参与者在一天中分次补充合生元，随后没有进一步胃肠道不适进而完成了实验。很多关于合生元干预NAFLD实验，都包括了个体正常药物干预。我们的实验个体除合生元干预外，没有其他的可能会减少肝脏脂肪的药物的干预，很多研究都没有考虑或者分析数据时没有对混杂因子进行校准，例如锻炼和体重变化。并且很多研究没有提到样本大小，不提供统计功效（Statistical power），样本量不足会导致1类型的统计学错误。这些都会影响实验结果。之前的研究了囊括了多菌种的合生元对NAFLD影响，对NAFLD有改善作用，可能是因为添加多重菌种比单独一个菌种效果要好，因为能够影响更多的肠道细菌种类，而这仅仅我们的猜测，因为这个研究也包括了药物的使用，并没有对药物的影响进行消除。另外一个影响可能是每个个体对合生元的反应是不一样的。我们的研究没有对肠道菌群在基线水平上进行随机区块分组，所以我们也不知道哪些个体对合生元具有反应。
这个研究我们既有优势也有劣势。优势是：研究的安慰剂对照；长时间的干预；对参与个体的充分了解；在回归模型上对混杂因子进行参数调整；我们之前用了体外模型进行模拟。我们的劣势是：第一，我们只选择了一中益生菌，尽管Bifidobacterium animalissubspecies lactis (BB12)很容易定殖并有益于肠道以及果寡糖可以改善脂代谢。在肠道菌群失调情况下，革兰氏阴性菌产生大量毒素，损害肠道，并通过血液循环达到肝脏从而损害肝脏。我们的理论是使用益生菌改善肠道菌群，从而减少肠道毒素对肝脏的危害。其次，该研究被设计为2期临床试验，以测试此干预措施对肝脏脂肪的影响对肝脏脂肪的测量使用的是MRS而非肝脏活检。已知NAFLD是一种“斑片”疾病和肝脏活检是侵入性的，昂贵的，并且受样品变异性的影响。因此，我们没有实验设计中包括对肝活检的要求。MRS是目前被认为是用于精确测量肝脏脂肪改变百分比的非侵入性的金标准技术，并具有出色的重现性和敏感性。另外，MRS是一种非常敏感的技术，肝脏脂肪信号高于背景噪声水平0.2％以上，就可以得到测量。此外，由于合生元是安全，便宜的营养补充剂，可广泛获得，我们还认为，如果合生元在NAFLD的治疗中占有一席之地，那么可能是在早期疾病发展过程中，对降低肝脏脂肪含量有作用。因此，我们的意图是测试合生元干预对肝脏脂肪含量的影响，而不是评估NASH的组织学上的变化，NAFLD活动评分的改善或改善肝纤维化。最后，我们没有在实验过程中囊括病人的药物干预，因为我们的意图是测试单用合生素干预的效果，消除了这个混杂因子。
结论
总之，我们的双盲，随机的，对照实验结果表明，合生元治疗，与安慰剂相比，（4 g聚合度<10的低聚果糖，每天两次服用；再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天至少100亿个CFU，持续约12个月）可以有效改善NAFLD患者的肠道菌群。但是，这种治疗方法无法降低的肝脏脂肪含量或改善肝纤维化评分或肝硬度值。有趣的是，合生元和安慰剂组都显示出，体重减轻了1 kg，且体重每减轻1kg，肝脏脂肪含量就减少2％（有显著的相关性）。体重减轻也与肝脏纤维化得分和肝硬度有关。因此，我们建议这种合生元对肠道菌群产生的影响可能不会对NAFLD患者肝脏中产生明显的改变。这种合生元对已知与炎症有关的特定微生物的改变需要我们对NAFLD中的炎症/免疫相关参数进行探究。
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