科研 | Water Research: 宏基因组分析表明中试规模改进型AAO系统耦合电解中低碳氮城市污水中的营养物质去除增强

编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。原创微文，欢迎转发转载。导读传统的污水生物处理法因进水有机碳不足，难以提高营养物质去除效率。针对微生物对碳源依赖性高的问题，研究人员开发了一种将电化学过程与A2O （厌氧/缺氧/缺氧）工艺相结合的技术，以强化对低碳氮比污水中氮和磷的去除效果。应用该技术，总氮（TN）和总磷（TP）的平均去除率分别达到77.24%和95.08%，比对照反应器提高了13.88%和21.87%。氮磷空间分布变化表明，电解法耦合A2O工艺使好氧区NH4+-N（铵态氮）去除率有所提高。在厌氧室由于电解作用产生电子，随着反应过程中NH4+-N和NO2 -N的少量积累，总氮消减主要表现为NO3 -N的减少。此外，经测定发现亚磷含量几乎没有变化，表明化学沉淀应该是电解除磷的主要机制。开发微生物电化学系统用于污水处理方面已有大量研究工作报道，该课题组前期就构建了较为成熟的实验体系，验证了其应用的可行性，并讨论了通过电解耦合生物处理过程净化废水的运行参数。然而，该体系涉及微生物群落结构及其代谢机理方面的特征仍不明确。在评估电解- A2O系统长期稳定运行性能的基础上，本研究测定了91天污泥样本的宏基因组以探讨电解强化脱氮除磷的生物学机制。结果表明，在电解耦合体系中放线菌门被显著抑制，变形菌门占主导地位，特别是硝化细菌和多种自养反硝化菌被富集。与对照相比，电解法耦合A2O体系中异养反硝化菌群发生了明显变化，这主要体现在念珠菌属丰度的减少。批试验进一步证实，以H2和Fe2+为关键电子受体的自养型反硝化菌对电解诱导的反硝化起主要作用。从酶和功能基因的角度可以揭示该体系在微生物代谢能力方面的差异，网络分析可以洞悉物种和功能基因之间的关联，并表明在电解- A2O系统中，自养反硝化菌和反硝化功能基因之间存在更强的相关性。论文ID原名：Metagenomic analysis reveals enhanced nutrients removal from low C/N municipal wastewater in a pilot-scale modified AAO system coupling electrolysis译名：宏基因组分析表明中试规模的改进型AAO系统耦合电解中低碳氮城市污水中的营养物质去除增强期刊：Water ResearchIF：7.913发表时间：2020.2通讯作者：何强&周健作者单位：重庆大学城市建设与环境工程学院实验设计本研究建立了两个结构相同的改进型塑料A2O反应器(图1)并行运行，依次由厌氧区、第一缺氧区(缺氧1)、第一好氧区(好氧1)、第二缺氧区(缺氧2)、第二好氧区(好氧2)和二沉池组成。对照组反应器 R0为无电解装置的A2O体系；R1处理组为缺氧2室中安装电解装置的耦合A2O体系。阳极铁丝网，阴极石墨电刷，电极之间距离15cm，外加直流电源。试验在重庆一污水处理厂进行，从预沉淀池收集未经处理的废水，好氧生化池中取得污泥用于接种，运行时各项参数如下，HRT：10 h，SRT：15d，DO：2-4 mg/L，电压范围：4 - 6v。为评价电解体系中生物和非生物的贡献度，定量识别各电子供体的作用情况，在稳定运行后采用相同电极材料和电流等参数进行了不同底物条件的批试验(表1)，用密封烧杯(1L)作反应器，将R1缺氧2室收集的污泥用去离子水洗去残留的氮，平均分配给各组（除B1组外），再加入基质并搅拌混合进行培养。

图1 中试规模电解- A2O反应体系示意图。试验过程中采集样品，测定NO3--N和SO42--S，通过线性回归法得到他们的最大还原速率。用分光光度法测定COD、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN和TP的浓度，用离子色谱法分析SO42--S含量，用烘干称重法测定MLSS和MLVSS，用便携式仪表监测DO、温度和pH，用扫描电子显微镜观察污泥形态。第91天收集了两个反应器内的污泥样本并提取DNA进行测序（Illumina Hiseq4000平台），由Sickle筛出低质量reads，将clean reads组装成最小长度为300 bp的contigs，使用MetaGene预测ORFs（open readingframes），提取长度≥100 bp的ORFs翻译成氨基酸序列。基因通过CD-HIT 进行聚类，并选择每个聚类中最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。利用BLASTP 检索非冗余基因集中的代表性序列，将其与NCBI NR和KEGG数据库比对，进行分类和功能注释，进一步确定N代谢相关功能基因在样品中的相对丰度。在STAMP软件中采用Fisher检验法对两样本间N代谢相关酶的丰度差异进行统计分析。表1 不同基质条件下批实验分组情况Batch testB1B2B3B4B5ConditionEE-BE-BE-BBSubstrateNO3--NSO42--SSO42--SNO3--NNO3--NSO42--SNO3--NSO42--S注：E 无污泥接种的电解体系，E-B 电解-生物体系，B 无电解装置生物体系结果1 反应体系性能监测与比较由图2，R0出水以NO3--N（11.43±0.60 mg/L）为主，存在微量NH4+-N和NO2 --N (<0.5 mg/L)，平均总氮去除率为63.37%，推测因缺乏有机碳源用于反硝化，限制了进一步脱氮。相比之下，尽管出水NH4+-N和NO2 --N浓度与R0相似，运行13天后R1中硝态氮浓度从11.04 mg / L下降到6.79 mg / L，后稳定在6.88±0.50 mg / L，表明电解法耦合A2O体系迅速构建。R1的平均总氮去除率为77.24%，较对照R0增加13.88%。R1在运行开始后总磷去除率迅速上升，4天后出水TP浓度为0.19±0.04 mg/L，总磷平均去除率达95.08%，明显高于R0的73.21%。电解耦合体系中PO43-- P的有效去除主要是得益于金属阳离子参与的化学沉淀过程，阳极电解产生的铁离子或可强化除磷。综上所述，电解- A2O体系可以快速提高氮(NO3--N为主)和磷的去除效率，且能够长期稳定运行。随着进程推进，R1中的MLSS浓度高于R0，这可能是由于溶解的二价铁被氧化使固相中铁残留增多。同时，各反应器间MLVSS差异不大，说明生物质含量相近。可以推测，进水中有机物引起的异养增殖是生物量浓度的决定因素。

图2 实验期间（91天内）R0和R1体系的养分去除情况。2 氮磷空间分布图3可以看出NH4+-N的去除主要发生在第一好氧区，R0和R1这里的平均铵去除率分别为4.91和5.96 mg NH4+-N/ (gVSS·h)。虽然不同处理组NH4+-N流出量没有差异，但电解- A2O体系对硝化速率有促进作用。同时，R1对TN的去除明显强于R0，差异主要来自厌氧区和第二缺氧区。回流污泥中NO3--N含量的不同可以解释厌氧池中总氮含量的差异，而R1缺氧2室中总氮的减少应归因于电解体系的作用。以缺氧2室为研究对象，R0中亚硝酸盐氮含量的降低(平均0.2 mg/L)占主导，这主要由于反应器中有机碳源不足。相比之下，虽然在R1缺氧2室中发现少量NH4+-N和 NO2--N 的积累，但NO3--N(3.54 mg/L)去除明显，总氮浓度显著下降。因此，电解法对氮去除的强化主要体现在硝酸盐还原上，此过程被认为是进一步除氮的限速步骤。在其他生物电化学系统也中广泛观察到硝酸盐异化还原所产生的NH4+-N积累，这里电解耦合体系中发现了类似现象，相关生物学机制后面通过宏基因组数据阐述。在P的分布上，R0中磷含量沿反应器呈不断下降趋势，而R1中磷浓度几乎保持不变，处于较低水平(<0.2 mg/L)。

图3 R0 (A) 和 R1 (B)体系中N、P和DO在不同反应室中的含量变化情况。3 微生物群落结构和功能经比对发现微生物群落中主要为细菌（约99%），图4A和4B显示了样本中门和纲水平的物种相对丰度信息。R0中优势物种为放线菌门(40.59%)，其次为变形菌门(25.10%)。R1中发现优势物种变为变形菌门，说明通过耦合电解装置可以抑制放线菌生长，富集变形菌门。放线菌门的放线菌纲和酸化菌纲通常能够维系微生物絮凝体稳定，在R1中分别下降了6.37%和9.99%。本研究中，R1收集到的污泥絮凝体比R0尺寸更小更致密，上述两类放线菌减少或为造成污泥结构差异的诱因。变形菌门的四个亚种(Alpha-、Beta-、Gamma-和Delta-)均在R1中有所增多，自养反硝化菌等许多脱氮相关细菌都属于上述几类，R1中微生物群落变化后可能使体系表现出较强的除氮性能。由图4C，属水平上，硝化单胞菌和硝化螺旋菌是两体系中主要的氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)，它们在R1中的相对丰度分别增加了0.33%和1.05%，这一变化可以解释R1体系好氧区NH4+-N去除率的提高。尽管两体系中丰度较高有反硝化能力的CandidatusMicrothrix属在R1中减少，Ardenticatena属变化不大，本研究发现其中存在多种异养反硝化菌群，多数丰度在R1中有所增加，如Lautropia、Ottowia等。污水处理厂中常见的丝状菌Candidatus Microthrix具有脂质代谢能力，相对丰度从R0的11.54%下降到R1的2.97%，生长活动受电解体系的抑制，废水中丰富的油脂可能是其成为优势菌的主要原因。添加铁盐可以抑制小型假丝酵母生长，则电解产生的铁离子或为导致该种属在R1中丰度减少的原因。相较对照，R1体系提供更多自由电子有利于实现反硝化，电场环境也使反硝化菌群生长代谢更活跃。Anaeromyxobacter能够利用不同末端电子受体氧化有机物和氢，相对丰度从0.13% (R0)显著增加到0.75% (R1)，这与添加三价铁导致Anaeromyxobacter大量积累的报道相符，因此电解- A2O系统是该菌种的适宜环境，它在氮代谢方面的作用我们后面再说。

图4 门(A)、纲(B)和属(C)水平上的微生物群落组成。仅显示丰度较高的前50个属，无分类学信息的属归为其他类，数据为经log10对数变换后的值。4 自养反硝化菌和电子供体各种自养反硝化菌作为电子受体在R1体系中大量存在，电解产生H2，二价铁，为反硝化菌提供电子，电解条件下自养反硝化菌可以更好地除氮。其中只有两种是典型的硫化物依赖型自养反硝化硫氧化菌(反硝化硫柳菌和硝酸还原硫代碱弧菌)。硫酸盐还原菌(SRB)可以直接获得H2或电极的电子，在生物电化学系统中生长得更好，推动了包括硫基自养反硝化在内的整个硫循环。为进一步鉴别电解装置还原过程中的电子来源，通过试验分析发现，非生物处理组B1硝酸盐还原速率为3.62 mg N/ (L·h)，占电解辅助生物试验组B4(10.42 mg N/ (L·h))的34.8%。在电解-生物处理组中，加入SO42--S和未加入SO42--S(B3和B4)的反应体系硝酸盐还原速率相似，即S循环不是必要的电子供给方式，仅在高S/N条件下才会发挥重要作用。在不添加硝酸盐的B2组中，硫酸盐还原速率为0.624 mg S/ (L·h)。结合B4的结果，通过硫元素存储和再供应的电子最多为0.156 mmol e- /h，占硝酸盐还原过程中电子量的不到6.99%。R1中SRB相对丰度较低，这也再次佐证了硫元素循环对于驱动电解脱氮作用很弱。在无电解作用的B5处理组中，SO42--S含量稍有增加，这可能是污泥中沉积S (FeS、FeS2和S0)被氧化的结果，而试验期间没有发现明显的NO3--N减少，这证明了沉积硫的电子存储作用可以忽略。因此推断，H2和Fe2+是电解体系中主要的电子供体。5 不同的氮代谢途径和功能基因为了揭示电解驱动脱氮的特征，根据KEGG数据库对关键酶和功能基因进行了鉴定和分类。本研究测序所得宏基因组中包含传统氮代谢途径涉及的关键酶，即硝化、反硝化、硝酸盐异化还原为氨(DNRA)等的相关功能基因。如图5A、5B所示，相比对照，催化NH4+-N氧化的关键酶(氨单加氧酶、羟胺脱氢酶)及其功能基因在R1中增多，或因硝化生物富集所致。关于电解对硝化细菌的影响还不明确，有研究报道耦合电解和非电解体系人工湿地出水NH4+-N浓度差异不显著，与本研究相似，但电解加快氨氧化速率及对AOB、NOB和氮转化相关基因的积极作用可通过宏基因组分析确定。

图5 氮代谢途径中关键酶(A)(***表示有统计学显著差异，采用Fisher检验，p<0.05)和功能基因(B)的相对丰度(采用Circos进行数据可视化)。在反硝化途径方面，硝酸盐还原酶的丰度明显增加，说明电解法可有效促进硝酸盐还原过程，这也表现为NO3--N的进一步去除。此外，在两个样本中均检测到narG和napA，编码细胞周质硝酸还原酶催化亚基的功能基因，分别比R0中检测到的增加了2.67%和34.3%。其他两类脱氮相关关键酶，即一氧化氮还原酶(由norBC编码)和氧化亚氮还原酶(由nosZ编码)，丰度显著增多。表明电解- A2O强化脱氮过程更倾向于将氮元素最终转化为氮气。以亚硝酸盐还原酶为研究对象，R0和R1之间无统计学差异，这或可解释R1中测得的亚硝酸盐积累。然而，编码不同类型亚硝酸盐还原酶的nirK和nirS的丰度在R1中分别下调27.0%和上调52.2%(图5B)，即编码亚硝酸盐还原酶的基因发生了从nirK向nirS的转换，偏好完全反硝化 (NO3--N→N2)的nirS型反硝化菌可能逐渐主导电解耦合A2O体系中亚硝酸盐的还原。此现象与NO和N2O还原酶的有关讨论相一致，进一步证明了电解- A2O促进完全反硝化。异化亚硝酸盐还原酶的功能基因丰度也在电解法体系样品中增加，这可能是其中NH4+-N少量积累的潜在驱动力。同化硝酸盐还原酶相对丰度在R1中较对照明显降低，所涉及的具体原因在后续的网络分析中详细讨论。6 网络分析和微生物物种-功能基因间关联为了揭示氮代谢功能基因（NFG）的主要宿主，进一步探讨微生物在其中作用规律，采用网络分析法，探索NFG亚型与物种（属水平）间相关性。关联度的概念被用来描述某个属对NFGs的贡献，通过该属所携带NFG亚型的比例来计算。共筛选得47个属(R0)和52个属(R1)作为关键宿主，两者共有39个属，分别在R0和R1中通过122和145个连接与NFGs相连，如图6所示。

图6 R0(A)和 R1(B)体系样本的功能基因与物种分类关联分析网络图。矩形节点代表不同的功能基因，圆形节点代表微生物，节点大小表示连接数量多少，此处只展示相关性>1%的连接，线宽与相关性成正比。对于R0，7个NFG亚型分别分配给慢生根瘤菌和亚硝基单胞菌，将它们视为网络中的“枢纽”。慢生根瘤菌携带napA、napB、nirS、nirB、nirD、nasA、nirA的相关程度分别为20.1%、23.0%、3.4%、5.9%、1.8%、1.5%、3.4%。说明R0中慢生根瘤菌在硝酸盐还原过程中发挥了重要作用，参与了反硝化、同化和DNRA途径。亚硝基单胞菌与nirK、norB、norC、amoA、amoB、amoC、hao均有相关性，其中90%以上的amoA、amoB、amoC和76.1%的hao均属于亚硝基单胞菌，表明了它在氨氧化中的主导作用。值得注意的是，R0中丰度较高的Candidatus Microthrix和Ardenticatena与少数NFGs关系密切。如nirK和nasA主要存在于Candidatus Microthrix中，其关联度分别为17.6%和68.6%，说明该菌主要参与了脱氮(NO2-- N还原为NO)和同化硝酸盐还原。因此，R1中同化硝酸盐还原酶基因丰度的降低应归因于该属微生物生长受到抑制。Ardenticatena是nosZ(37.3%)、nrfA(29.8%)和nrfH(43.1%)的主要宿主，说明Ardenticatena属是R0中主要的N2O清除者，也参与DNRA过程。与R0相比，R1网络中属种更多(图6B)，关键宿主连接相似。如亚硝基单胞菌都与氨氧化相关基因关系密切，Ardenticatena也都是nosZ、nrfA和nrfH的主要宿主，在R0和R1中的作用相同。然而值得注意的是，一些共有属和NFGs之间相关程度不同，例如处理组慢生根瘤菌属与napA的关联度下降了7.7%。相反，潜在的自养型反硝化菌Sulfuritalea和Simplicispira与napA的关联度更高(分别为14.3%和11.5%)。此外，由于处理组CandidatusMicrothrix丰度降低，这里可以清楚地看到R1中该属携带nirK的减少，这可能进一步使R1中亚硝酸盐还原酶基因从nirK向nirS转换。除共享连接外，R1网络中还存在一些特征节点和连接，更为复杂。R1中Sulfuritalea与nirS之间另外建立了新连接，证实了该菌在亚硝酸盐还原过程中起更重要的作用。其他仅在R1网络中出现的自养反硝化菌(如Rhodanobacter、Candidatus Brocadia、hydroophaga、Thioalkalivibrio)也成为多个反硝化基因(narG、narH、napA和napB)的主要来源。综上，多种自养反硝化菌在电解- A2O体系中反硝化过程有所强化。这里Anaeromyxobacter仅存在于R1网络，并与多种NFGs相关。与Anaeromyxobacter相关的编码亚硝酸盐还原酶基因很多，且其以氢为电子供体，所以该属良好的生长情况某种程度上可以解释电解体系中DNRA过程的强化。DNRA被认为是Anaeromyxobacter主要硝化途径，本研究还发现该属携带多种反硝化基因，揭示其在电解- A2O系统中具有潜在的反硝化作用。讨论本文通过分析经电解处理前后微生物群落结构及代谢机制，探讨解电解-A2O法强化低碳氮比城市污水中营养元素去除的相关分子机理。通过在缺氧2室中安装电解装置，可以显著提高氮和磷的去除效率，并保持91天稳定运行。总氮去除率的增强主要表现在缺氧2室，各反应区均有痕量磷检出。基于宏基因组的物种比较表明，电解干预对Candidatus Microthrix（小念珠菌属）有不利影响，相反促进了硝化细菌、大量自养反硝化菌和大多数异养反硝化菌的生长。其中，以H2和Fe2+为直接电子来源的自养型反硝化菌在电解驱动的反硝化过程中起着关键作用。此外，在R1体系中还发现了Anaeromyxobacter（厌氧杆菌属）的明显富集，并通过网络分析验证了其在DNRA和反硝化能力方面受到电解作用的强化。分析氮代谢途径发现，除亚硝酸盐还原作用外，电解- A2O法显著增进了整个硝化和反硝化进程的相关功能基因丰度。同时，在硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的不同亚型中，napA和nirS编码的酶似乎对电解作用更敏感。总的来说，本研究的发现对电解耦合活性污泥体系有了进一步认识，并为其在污水处理厂的工程应用提供了理论依据。

你可能还喜欢

2019年度回顾 | 微生态环境微生物类微文大合辑2019年度回顾 | 微生态人体/动物微生物类微文大合辑2019年度回顾 | 技术贴合辑大放送