综述|欲了解代谢组学及其在心血管疾病中的应用，此文足矣！
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在人的一生中，心脏跳动约25~40亿次。然而，尽管心脏一天水解掉它质量20倍的ATP，确只储存了跳动所刚好足够的能量。心脏必须持续适应营养物供应、生理需求的变化，来满足不间断的能量需求。心脏利用如糖类、脂肪、乳酸、氨基酸等多种能量源来生成ATP，为它供能。由于心脏需要持续的能量，所以通常心脏代谢出现紊乱，则会引起心血管疾病。探讨代谢紊乱，代谢组学是比较适合的技术方式，可以利用该技术对心血管疾病发病机理进行深入探讨，同时也能帮助寻找到一些潜在的心血管疾病biomarker。在这篇综述中，作者会向读者介绍代谢组学技术的现状，包括代谢组学平台、实验设计要点、同位素标记研究代谢流及代谢组学在心血管疾病中的应用。
论文ID
原名：Cardiovascular Metabolomics
译名：心血管代谢组学
期刊：Circulation Research
IF：15.211
发表时间：2018年
通信作者： Christopher B. Newgard
通信作者单位：Duke Molecular Physiology Institute, Duke University Medical Center, 300N Duke St, Durham, NC 27701
综述内容
1 非靶向和靶向代谢组学
非靶向代谢组学是一种试图尽可能多的从生物样品中检测、鉴定和相对定量代谢物的综合分析技术，目的是区分与特定基因型、药理治疗、临床分组相关的独特代谢物特征。该技术面临最主要的挑战为代谢物鉴定。
与非靶向代谢组学不同，靶向代谢组学支持对选定的一组代谢物进行定制分析，进而完成绝对定量。靶向技术带来的优势在于更高的灵敏度和选择性。
2 代谢组学研究注意要点及设计思路
下图为组学研究示意图：
图1 常用的代谢组学研究流程
2.1 实验设计和样品准备
麻醉与安乐死
在设计动物实验时，所使用的麻醉和安乐死的方式非常重要。很多研究指出在获取组织前，动物有没有接受麻醉或者安乐死会导致组织中的代谢物浓度发生很大的变化。一般看来，安乐死导致的代谢物变化与组织局部缺血比较一致，如导致乳酸、琥珀酸、酰肉碱的积累。因此，组织应该在麻醉条件下收集，而不是在实施安乐死以后。同时，应该选择合适的麻醉方式，尽量以最短的时间从机体中收集到想要的组织样品。
样品收集和准备
实验设计和样品收集的许多方面最终都会影响测定到的代谢物浓度。比如，那些具有不稳定功能基团的代谢物会被快速降解，有些代谢物又对温度、pH、氧浓度和光照特别敏感。因此，若在样品采集至冷冻之间耗时太长，会导致测得的代谢物浓度较低（反复冻融也有类似的效果）。在准备样品和进行操作时，尽可能的使样品始终保存在-80℃的条件。
此外，目前尚无统一的提取技术可以提取整个代谢组，所以选择不同的提取试剂会影响检测到的代谢物。最后，值得注意的是，昼夜变化、饮食组成、药物使用等因素都需要考虑进去。
2.2 数据获取和特征检测
分析要点
非靶向代谢组学技术在分析人临床疾病时，会涉及到成百上千的样品，合适谨慎的设计流程可以保证批次内或不同批次间分析的可重复性。在大规模研究中，以下几点是比较好的建议：（1）设置方法空白用于分析，可分析样品处理、加工和储存过程中引入的潜在污染；（2）准备所研究对象的混合样品，包括批次内、批次间多个时间点的混合代谢物样品，用于质量控制；（3）对生物样品线性评估，将小样稀释至不同倍数，找到最优的检测和定量指标用于正式分析。
NMR代谢组学平台
一些原子核，如1H,13C,15N和31P，具有固有的核自旋频率，因此带有磁场。NMR通过外在磁场的快速变化，激发核自旋，并且记录该过程中所释放的电磁辐射作为核辐射结果。
与质谱平台相比，NMR具有非侵入和样品无损的优势。因此，对于人类或实验动物的体内研究，及灌注组织系统的原位研究，NMR都是适用的平台。同时，NMR具有多样的谱图库，可以提供详细的结果信息用于鉴定。但是，NMR的灵敏性比较差，代谢物覆盖度也比较低，核磁往往一次检测几百种代谢物，而质谱能检测几千种代谢物。
1H-NMR（质子NMR）是最为广泛使用的NMR技术，常用于与心血管新陈代谢有关的多种应用领域，如监测体内心肌脂质的变化，测定总肌酸的含量等。
质谱代谢组学平台
质谱法基于被分析物的离子化，测定这一过程中产生离子的强度，按质荷比（m/z）进行记录。m/z的谱图和碎片信息可用于代谢物鉴定。质谱主要由3大部件所组成：（1）电离源（2）质量分析器（3）离子检测器。
在上质谱之前，需要对样品进行分离，这时往往需要运用到气相色谱（GC）或者液相色谱（LC）。色谱分离增加了选择度，同时通过降低给定时间进入质谱的共洗脱化合物的数量，来减少潜在的离子抑制效应。
气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）
GC-MS具有强大的性能，如分离性能强悍、高重复性保留时间、以秒为单位的峰宽等。GC需要挥发性的代谢物和气相介质，然而自然条件下，绝大多数生物代谢物都不具备挥发性，需要采用化学法进行衍生化。同时，GC-MS不适用于分析化学不稳定、热不稳定和极易降解的化合物，代谢物覆盖度也不高。尽管具有这些缺点，GC-MS常被用于分析组织和体液中有机酸/氨基酸，也分析治疗和药物滥用过程中的分解产物。
GC-MS采用电子碰撞离子化的方式，在标准电子能量下产生报告图谱用于未知代谢物的鉴定，建立了大量的电子碰撞谱图库，如NIST（National Institute of Standards and Technology）数据库。
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）
由于对高性能LC进行改进、超高性能LC技术的出现及多样的色谱柱介质，LC现在可用于分离大范围的代谢物，因此非常适用于对体液和组织样品高通量、全面综合的代谢组分析。常用的固相介质包括反相色谱、亲水作用色谱及多孔石墨碳。
不同于GC-MS，LC-MS技术不需要挥发性的分析物，并且在样品提取后没有大量的处理工作。另外，不同于GC-MS电子碰撞的碎片化方式，LC-MS具有最低的源内碎片化过程，可以保留代谢物化学主干，用于检测未知化合物的分子质量和原子组成。如果有需要，可以进一步碎片化获得MS/MS谱图。
LC-MS系统利用三重四级杆完成靶向分析，具有高灵敏度，能够对特定ion transition进行选择。
图2 代谢组学研究技术平台比较
3 统计学分析和特征鉴定
3.1 代谢组学数据处理和分析
与其它组学技术类似，每个样品可以生成几百至几千个代谢组数据点。因此，对数据的解读和分析必须依赖于先进的计算机技术。合适的代谢组学数据处理，对产生可信的高品质数据集用于后续分析非常重要。同时，QC样品对大样本量的研究至关重要，对于数据分析前的样本批内重复性和一些指标（如信号、保留时间、精确的质量）的潜在漂移进行检测和判断。
在样本检测完后，常通过仪器制造商提供的软件或诸如XCMS的开源软件的处理原始数据。这一过程会对与运行顺序有关的数据进行校对，保证各样品中所鉴定的代谢物特征具有同一参数。
接着，使用传统的统计学方法调整基于Bonferroni或者FDR阈值的多元比较分析。同时，对数据进行降维用于降低多元比较的统计载荷，常用的方法包括主成分分析法和聚类分析法。
3.2 代谢物特征鉴定
对于非靶向代谢组学而言，其中最大的一个挑战是对未知谱图特征的鉴定。在这一方面，前面也提到NMR技术相较于质谱技术有显著的优势。而质谱数据通过提供保留时间、精确的质量，MS和MS/MS谱图及同位素分配信息用于鉴定。
为了能够鉴定代谢物，需要已知标准物质的谱图和保留时间数据库。对于靶向代谢组学，可以检测目的化合物来获得实验室内部的数据库，但是对于大规模非靶向技术确不适用。不过可以利用现有的一些公开数据库进行鉴定，如HMDB、Metabolomics WorkBench、MetaboLights database等。
3.3 代谢组学中稳定同位素的应用
代谢通路是复杂的酶促反应交联网络，而在体内大多数代谢物维持着相对较小的变化幅度，也不能通过代谢通路直接表明代谢流（代谢速率）。靶向的和非靶向的代谢组学技术都是对感兴趣的生物样品代谢状态的静态测定，而代谢流能够动态的检测底物在代谢通路中的流动。
对于代谢流的测定通常利用稳定同位素（2H,13C,15N），这类物质是自然存在的，不具备放射性。稳定同位素可用于鉴定特定底物下游代谢产物，检测其在代谢通路中的“流动”情况。稳定同位素技术依赖于与“静态”代谢组学一样的仪器（NMR和MS）和类似的检测方法。
图3 选择13C底物，乙酰CoA出现不同的标记
4 心血管疾病中的应用
基于科研工作者对心血管疾病代谢基础研究兴趣的增长，代谢组学成为非常有用的科研工具，其中一个最为重要的应用方向就是寻找心血管疾病新的Biomarker。同时，也可以探究不同疾病状态下全身性代谢紊乱，从而对心血管疾病病理生理学分析提供关键数据。
4.1 心肌肥大
当心脏遭受肥大，必然会改变其生长的代谢活动。代谢组学研究显示这一过程随着生理条件的变化而改变。比如，心脏肥大与长期运动训练（生理性肥大）和慢性血液动力压力（病理性肥大）相关。虽然心脏的结构在这两种条件下高度相似，但有着不同的分子和代谢特征，表明具有一些潜在的生长“程序”。科研人员已运用代谢组学、同位素示踪和代谢流技术对这两种肥大形式的分子、代谢变化做了分析。
4.2 心脏衰竭
有研究结合LC-MS/MS和GC-MS技术，无偏差的分析主动脉缩窄和梗塞性心衰小鼠代谢性变化。研究人员发现在两种条件下，测得的288个代谢物40%以上都发生了显著变化。诸如嘌呤、酰肉碱、脂肪酸和鞘脂类物质，随着时间增加含量有所降低，表明了能量代谢全面的影响作用，还伴随着氧化应激标志物含量的增加。此外，研究人员还发现了支链氨基酸（BCAA）在衰竭心脏中有所累积，而该物质与心肌胰岛素抵抗相关。
4.3 心血管代谢疾病
过去的十年里，代谢组学技术在分析代谢性紊乱方面具有优势，特别是胰岛素抵抗、2型糖尿病与BCAA和其它相关代谢物的关联分析。比如，采用靶向MS/MS技术，发现相较于脂质相关的代谢物，BCAA代谢物因子可以更好的区分“瘦的”和“胖的”个体，与胰岛素抵抗标志物之间也有更强的关联性。同时，不断发展的基础科学研究开始揭开BCAA、葡萄糖和脂质代谢之间复杂的相互作用，及其可能导致的系统性代谢紊乱。
4.4 心血管疾病风险的预测
鉴定生物标志物，并用于预测心血管疾病风险，也是同样重要的代谢组学应用领域。比如，基于LC-MS/MS的靶向定量代谢组学技术用于揭示流动的BCAA代谢物因子对阻塞性冠状动脉疾病个体的预测价值。
其它用于预测的研究还包括肠道微生物与宿主代谢物相互关系预测心血管疾病风险等方面。
5 未来发展方向
对于分子数据集的整合能提供一种有力且新颖的方式综合分析心血管和心血管代谢紊乱。过去十年，一些研究小组已经将GWAS（全基因组关联分析）与代谢组学数据进行整合，探寻基因变异对代谢物浓度流动的贡献。相似的研究最近也开始着眼于表观遗传和代谢组学关联分析。
结论
后基因组时代带来了新的方法和机遇，研究心血管疾病风险预测和发病机理也能更加深入。不像其它组学，代谢组学技术可以与上游的基因组、转录组和蛋白组变化、甚至环境因素进行功能性结合，反应最接近疾病状态的分子进程。