MPB：清华杨云锋组-利用GeoChip分析环境微生物功能基因群落结构
为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量，本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后，采用公众号推送方式分享全文，任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题，建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https://kdocs.cn/l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时，文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表，同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。
利用GeoChip分析环境微生物功能基因群落结构
Analysis of microbial functional gene community structure in environmental samples by GeoChip
郭雪*，杨云锋
环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，环境学院，清华大学，北京
*通讯作者邮箱: guoxue0601@mail.tsinghua.edu.cn
摘要
GeoChip是一种高通量基因芯片，包含了编码参与多种地球化学循环（如，碳循环、氮循环、硫代谢、磷利用、金属抗性、有机物降解等）的微生物相关功能基因的寡核苷酸探针。目前，最新版的GeoChip 5.0 共有161,961探针，覆盖了1,447个基因家族的超过365,000个基因。与宏基因组测序技术相比，GeoChip芯片技术虽然无法用于未知物种或功能基因的检测，但它对已知功能基因的检测重现性更好，灵敏度更高。因而，GeoChip芯片技术被广泛地应用于土壤、海洋、森林、农田、湖泊、肠道等各种环境微生物群落分析之中，揭示微生物群落的代谢途径和功能基因群落结构变化。本文详细介绍了GeoChip芯片实验过程中DNA荧光标记制备、芯片杂交与扫描和数据分析，并列举了实验过程中的注意事项，期望能够为开展GeoChip芯片分析环境微生物群落的读者提供一定参考。
关键词: GeoChip，功能基因，微生物群落，芯片，高通量
材料与试剂
1. 各种型号枪头
2. 离心管
3. DNA 样品 (或cDNA)
4. 随机引物Random primer (3 μg/μL random hexamers; Life Technologies,)
5. dNTP (5 mM dAGC-TP, 2.5 mM dTTP; GE Healthcare )
6. CyDye (25 nM Cy-3 dUTP; GE Healthcare)
7. Klenow (imer; 40 U ml-1; San Diego, CA)
8. Klenow buffer (San Diego, CA)
9. 双蒸水H2O
10. PCR管
11. Qiagen QIAquick Kit试剂盒
12. 2×HI-RPM hybridization buffer (Thermo Fisher Scientific, USA)
13. 10*Acgh Blocking Agent (Thermo Fisher Scientific, USA)
14. Formamide (Thermo Fisher Scientific, USA)
15. Cot-1 DNA (Thermo Fisher Scientific, USA)
16. Universal standard (home-made common oligonucleotide reference standard)
17. GeoChip5.0芯片（180K或者60K）
18. Wash Buffer 1 (Agilent)
19. Wash Buffer 2 (Agilent)
仪器设备
1. 涡旋仪
2. 小离心机
3. PCR 仪
4. 离心机 (配备1.5 ml 转头)
8. 恒温水浴锅
9. 金属浴恒温仪
10. 移液器
11. Nanodrop核酸检测仪
12. 真空浓缩仪（Speed Vac；ThermoSavant）
13. 恒温箱
14. 分子杂交炉（Shel labs G2545A）
15. Agilent SureHyb组件
16. 芯片扫描仪NimbleGen MS200 Microarray Scanner (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA).
17. 磁力搅拌器
实验步骤
1.DNA荧光标记
1.1 按照如下表1配置DNA/随机引物混合体系（35µL），并分装于PCR反应管。
表1. DNA/随机引物混合体系配置
|
组成组分 |
35 µL体系 |
|
Random primer（3 µg/µL） |
5.5 µL |
|
DNA（100 ng/µL） |
10.0 µL |
|
H2O |
19.5 µL |
1.2 在制备DNA荧光标记时，一般需要500-1000 ng DNA样品，可以根据样品DNA浓度利用双蒸水（H2O）将体系调整至35µL。
1.3 利用振荡器充分混匀DNA/随机引物混合体系，利用PCR仪99.9 °C温育5 min，立即置于冰上冷却。
1.4 按照如下表2配置荧光标记预混合液体系。
表2. 荧光标记预混合液体系配置
|
组成组分 |
15 µL体系 |
|
10 x Buffer |
5 µL |
|
dNTP mix |
2.5 µL |
|
Klenow (imer) |
1 µL |
|
CyDye* (25 nM) |
0.5 µL |
|
H2O |
6 µL |
*荧光染料CyDye是光敏感性试剂，因而配置过程需要再暗室中完成。
1.5 将15 µL荧光标记预混合液加入到冷却的DNA/随机引物混合液中混合均匀，利用PCR仪37 °C温育6 hrs，95 °C热激灭活酶反应3 min，并立即4 °C冷却终止反应。
1.6 利用Qiagen QIAquick Kit试剂盒严格按照产品说明对荧光标记DNA样品进行纯化，用100 µL H2O或者 EB溶液洗脱回收DNA样品(卢慧 2013)。
1.7 利用Nanodrop测定荧光染料CyDye标记效率，效率最低应>50 pmol (例如，纯化DNA被100 µLEB溶液洗脱回收并且Nanodrop测定为0.8 pmol/µL; 100*0.8=80，因而荧光标记效率合格，可以用于芯片杂交)。
1.8 设置真空浓缩仪（Speed Vac）温度45 °C，运行时间 2 hrs，真空等级（Vacuum level）5.1，对荧光标记DNA样品进行彻底干燥。
2.GeoChip芯片杂交
2.1 利用27.5 µL双蒸水重新溶解荧光标记DNA样品，简短震荡并离心收集溶液于离心管底部。
2.2 目前最新版GeoChip 5.0有180K和60K两个版本(He等， 2007; Tu等， 2015; Shi等， 2019)，按照如下表3配置杂交预混合液体系用于180K或60K版本GeoChip杂交分析。
表3. 杂交预混合液体系配置
|
180K |
60K |
|
|
2*HI-RPM Hybridization Buffer |
63.5 µL |
27.5 µL |
|
10*Acgh Blocking Agent |
12.7 µL |
5.5 µL |
|
Formamide |
12.7 µL |
5.5 µL |
|
Cot-1 DNA |
5.5 µL |
2.4 µL |
|
Universal standard |
5 µL |
2.2 µL |
|
Total for each sample |
99.4 µL |
43.1 µL |
2.3 将配置好的杂交预混合液加入到溶解的荧光标记DNA样品中，弹动15 s并离心收集于离心管底部。
2.4 利用金属浴恒温仪95 °C温育3 min使得DNA变性，并立即转移至37 °C恒温箱中温育30 min。
2.5 37 °C条件下6000 × g离心1 min，并立即放回37 °C恒温箱中。
2.6 检查分子杂交炉设置温度为67 °C，转速20 rpm。
2.7 将一个垫圈玻片装入Agilent SureHyb组件底座上，标签正面为“Agilent”向上。
2.8 吸取112 µL (180K)或者50 µL(60K)杂交混合液，转移其中~110 µL (180K)或~48 µL (60K)至垫圈玻片中心部位，避免液体接触边缘垫圈和产生气泡。
2.9 将标签为“Agilent”的微阵列GeoChip玻片轻轻覆盖在垫圈玻片上，数字条码面朝上，避免GeoChip玻片于杂交混合液接触时产生气泡。
2.10 将Agilent SureHyb腔盖轻轻置于GeoChip玻片上，并将夹具组件滑动到底座和腔件中间，用手将夹具组件螺丝牢牢地拧紧，固定底座和腔盖。
2.11 垂直旋转组装腔体，确保垫圈内杂交液体没有气泡或者气泡可以随液体平稳移动 （如有必要，在桌面上轻击组件以移动固定的气泡）。
2.12 将Agilent SureHyb组件放置于分子杂交炉中杂交22-24 hrs，保证旋转平衡。
2.13 将200 mL Wash Buffer 2在43 °C水浴锅中温育过夜。
2.14 按照如下三个步骤对芯片进行清洗：
|
步骤 |
清洗液 |
温度 |
磁力搅拌 |
时间 |
|
拆解芯片 |
Wash Buffer 1 |
室温（~20°C） |
||
|
清洗1 |
Wash Buffer 1 |
室温（~20°C） |
200 rmp |
5 min |
|
清洗2 |
Wash Buffer 2 |
37 °C |
140 rmp |
1 min |
2.15 在清洗过程中尽量避免拆解后的GeoChip玻片暴露于空气中，避免玻片置于清洗液过程中形成气泡，同时保证只触摸GeoChip玻片的条形码部位或边缘。
3.GeoChip芯片扫描和数据分析
3.1 将GeoChip芯片插入到芯片扫描仪（NimbleGen MS200 Microarray Scanner）的载玻片架中，保证标签为“Agilent”一面向上，条形码一端在外侧。
3.2 利用 Multi-TIFF模式对芯片进行扫描，生成图片格式数据（图1）。
3.3 利用Agilent芯片读取转化软件（Agilent Feature Extraction program, v11.5）将图片文件转化为文本数据文件，并将数据上传至GeoChip分析网站（http://ieg.ou.edu/microarray/）对数据进行标准化(Zhou等， 2011; 谢建平 2011; Guo等， 2020)和后续统计分析。
图1. GeoChip芯片扫描生成结果示意图。正常清洗后GeoChip芯片扫描整体（a）和局部（b）放大效果示意图；毛絮污染后GeoChip芯片扫描整体（c）和局部（d）放大效果示意图
注意事项
1.DNA样品的质量对于荧光标记、芯片杂交和最终的数据质量影响很大，因此，尽可能得到高质量的DNA样品是GeoChip芯片分析最关键的第一步。
2.实验过程中用到的荧光染料对光比较敏感，在有条件的情况下尽可能做到避光或者所有实验过程都在暗室中进行。
3.实验过程涉及药品试剂较多，芯片杂交对温度等环境条件比较敏感，为避免批次效应尽量将所有样品在一批或者短时间内处理完成。
4.空气中悬浮颗粒和细小毛絮沾染在清洗后的GeoChip芯片上对后续芯片扫描影响较大 （图1），因而应尽量保证实验环境的清洁。
致谢
本项目由国家自然科学基金项目(编号：41907209)和中国博士后科学基金项目(编号：2018M641327、2019T120101) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41907209), the China Postdoctoral Science Foundation (2018M641327 and 2019T120101)]支持。
参考文献
1. Guo, X., Gao, Q., Yuan, M., Wang, G., Zhou, X., Feng, J., Shi, Z., Hale, L., Wu, L., Zhou, A., Tian, R., Liu, F., Wu, B., Chen, L., Jung, C. G., Niu, S., Li, D., Xu, X., Jiang, L., Escalas, A., Wu, L., He, Z., Van Nostrand, J. D., Ning, D., Liu, X., Yang, Y., Schuur, E. A. G., Konstantinidis, K. T., Cole, J. R., Penton, C. R., Luo, Y., Tiedje, J. M. and Zhou, J. (2020). Gene-informed decomposition model predicts lower soil carbon loss due to persistent microbial adaptation to warming. Nature Communications 11(1): 4897
2. He, Z., Gentry, T. J., Schadt, C. W., Wu, L., Liebich, J., Chong, S. C., Huang, Z., Wu, W., Gu, B. and Jardine, P. (2007). GeoChip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical, ecological and environmental processes. Isme Journal 1(1): 67-77
3. Shi, Z., Yin, H., Nostrand, J. D. V., Voordeckers, J. W. and Zhou, J. (2019). Functional Gene Array-Based Ultrasensitive and Quantitative Detection of Microbial Populations in Complex Communities.
4. Tu, Q., Yu, H., He, Z., Deng, Y., Wu, L., Van Nostrand, J. D., Zhou, A., Voordeckers, J., Lee, Y. J. and Qin, Y. (2015). GeoChip 4: a functional gene‐array‐based high‐throughput environmental technology for microbial community analysis. Molecular Ecology Resources 14(5): 914-928
5. Zhou, J. Z., Xue, K., Xie, J. P., Deng, Y. and Luo, Y. Q. (2011). Microbial mediation of carbon-cycle feedbacks to climate warming. Nature Climate Change 2(2): 106-110
6. 卢慧 (2013). 三江源典型高寒草甸不同海拔梯度土壤微生物研究, 青海师范大学.
7. 谢建平 (2011). 功能基因芯片(GeoChip)在两种典型环境微生物群落分析中应用的研究, 中南大学.