科研 | Molecular Sciences：比较根转录组学提供了对鹰嘴豆干旱适应策略的见解
编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。
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干旱对全球农作物生产都有不利影响，植物根系对水分吸收和干旱胁迫的适应至关重要。在本篇文章中，研究者比较了2种不同类型鹰嘴豆在不同生长发育时期对干旱诱导的根系表型变化和转录组差异。除在生殖生长期，耐旱基因型的根长和根表面积低于敏感基因型外，其余各时期，耐旱基因型在根系生物量、根长、根表面积根径均大于敏感基因型。转录组结果显示，各时期耐旱基因型的特异性差异表达基因数量均高于敏感基因型。GO分析揭示了差异表达基因的功能集中在细胞过程、代谢过程、应激反应、对非生物胁迫的响应以及对激素的响应等方面。本研究同时还发现，胁迫响应转录因子、激酶、ROS信号和清除、转运蛋白、根结瘤和氧脂生物合成等基因在耐旱基因型中的表达显著上调，可能与干旱适应有关。并且还观察到激素信号和生物合成基因的激活或抑制。本研究对植物根部的耐旱机制提供了新的见解，对鹰嘴豆的品种改良具有更广泛的意义。
论文ID
原文：Comparative Root Transcriptomics Provide Insights into Drought Adaptation Strategies in Chickpea (Cicer arietinum L.)
译名：比较根转录组学提供了对鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)干旱适应策略对见解
期刊：Molecular Sciences
IF：4.183
发表时间：2020年3月
通讯作者：Rajeev K.Varshney & Nitin Mantri
通讯作者单位：澳大利亚皇家墨尔本理工大学理学院、印度国际半干旱热带作物研究所
DOI号：10.3390/ijms21051781
实验设计
本研究采用2种基因型，2个处理条件，3个时间点完全随机区组设计。以干旱敏感型（ICC283）和耐旱基因型（ICC8261）两种不同品种鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)为材料进行栽种，在白天(28℃)和夜间(23℃)不同温度的受控生长条件下，随机分配为充分浇水（WW）和干旱胁迫（DS）两组，每天称重，并加水补偿蒸腾作用损失的水分。在播种后（DAS）30天、50天、70天采样，分别对应营养阶段（VS）、生殖过度阶段（RTS）、生殖阶段（RS）。取不同处理样本根部和地上部分进行表型量化分析，确定其根部的长度、表面积、直径和体积，叶片叶绿素含量和比叶面积等参数，SPSS计算其标准差和均值。取不同样本根组织浸入液氮，低温保存，进行后续转录组测序。表型分析和转录组取样均设置3个生物学重复。由于部分样品RNA降解，3个处于生殖过渡阶段的耐旱基因型(ICC8261)样本没有测序，共测序33（36-3）个文库。将转录组结果与鹰嘴豆参考基因组进行比对，富集分析后在鹰嘴豆蛋白文库中进行检索，并与TAIR数据库中的拟南芥蛋白序列进行比对，然后分析了转录因子（TF）、蛋白激酶的基因表达、ROS解毒系统、转运蛋白家族基因、根瘤发育基因以及激素相关基因。
结果
1.表型分析
在VS期，耐旱鹰嘴豆基因型(ICC8261)在干旱胁迫下的表型反应、根系相关性状(如干重、长度和表面积)显著高于敏感基因型(ICC283)(图1.A-C)。相反，在RTS期，敏感基因型的根长和表面积高于耐旱基因型(图1B,C)。RS期时，耐旱基因型的平均根径大于敏感基因型(图1D)。根体积和相对含水量(RWC)在两个基因型的所有生育阶段都相似(图1E,F)。
在干旱胁迫下，耐旱基因型的地上部分生物量在各个发育阶段均显著高于敏感基因型(图1G)。在RTS干旱胁迫期间，耐旱基因型的叶绿素含量显著高于敏感基因型(图1H)。耐旱基因型的比叶面积(SLA)在RS较低(图1I)。总体来说，鹰嘴豆基因型ICC8261和ICC283对干旱胁迫的反应不同，这与ICC8261表现出耐旱性的研究结果是一致的。
2.转录结果和GO分析
耐旱基因型共有2161个差异表达基因(DEGs)在营养生长期响应干旱胁迫，其中1214个DEGs上调，947个DEGs下调(图2A)。在敏感基因型中，获得1873个DEGs，其中821个DEGs上调，1052个DEGs下调(图2A)。维恩图分析显示，在这些基因型中，261个DEGs普遍上调，262个DEGs普遍下调(图2B)。值得注意的是，耐旱基因型中上调的61个DEGs在敏感基因型中下调，20个DEGs在敏感基因型中上调。
在RTS期，耐旱基因型共鉴定到4109个DEGs，其中2139个DEGs上调，1970个DEGs下调(图2C)。在敏感基因型中，共鉴定出3772个DEGs，其中2038个为上调，1734个为下调。维恩图分析显示，1163和1059个DEGs在两种基因型中分别普遍上调和下调(图2D)。其中，耐旱基因型上调的19个DEGs在敏感基因型下调，而耐旱基因型下调的3个DEGs在敏感基因型上调(图2D)。
对干旱响应基因进行GO分析。GO术语将基因分为生物过程、分子功能和细胞成分(图3)。在营养和生殖阶段，生物过程类别中最主要的术语是“细胞过程”、“代谢过程”、“对刺激的反应”、“对非生物胁迫的反应”和“对激素的反应”。在分子功能类别中，出现了“催化活性”、“结合”、“水解酶”、“转运蛋白活性”和“抗氧化活性”等术语。细胞成分类别包括诸如“细胞部分”、“细胞质”、“细胞内”、“叶绿体”和“细胞壁”等术语。这些结果表明，在干旱胁迫期间，根系经历了整体转录重编程。
3. 转录因子(TF)基因分析
在本研究中，AP2/ERF、ARF、bHLH、bZIP、C2C2-DOf、C2H2-DOf、GRAS、MYB、NAC和WRKY等多个转录因子家族存在差异调控。AREB/ABF家族转录因子ABI5(LOC101506390)在RS的耐旱基因型中特异性上调(FC:2.3↑)(图4)。此外，CBF/DREB亚家族成员，干旱诱导的DREB1A (LOC101511871; FC:1.3↑)和冷诱导的DREB1C (LOC101491872; Fc:1.7)在RS的耐旱基因型中上调(图4)。AP2/ERF家族转录因子如ERF098(LOC101502737,FC:-2.5↓)和ERF062(LOC101510582，FC：-8.6↓)分别在耐旱基因型和敏感基因型的VS处下调(图4)。但ERF113(LOC101512295)在VS时在耐旱基因型(ICC8261,FC:2.3↑)和敏感基因型(ICC283,FC;-4.7↓)之间被负调节(图4)。WRKY家族成员WRKY33(LOC101503578)在VS的耐旱基因型(ICC8261,Fc:5.1↑)和敏感基因型(ICC283，Fc：4.5↑)中表达上调(图4)。bHLH家族TF在VS和RS耐旱基因型中表达上调。例如，在VS中，VIP1(LOC101494682;Fc:1.1↑)和bHLH18-like基因(Loc101507246,Fc:1.61↑)在耐旱基因型(ICC8261;Fc:1.7↑)和敏感基因型(ICC283;Fc:2.7↑)中都表达上调(图4)，而bHLH18基因(Loc101507557)在耐旱基因型(ICC8261;Fc:1.7↑)和敏感基因型(ICC283;Fc:2.7↑)中都表达上调(图4)。在RS中，耐旱基因型大量诱导VIP1(LOC101494682;FC:1.2↑)、bHLH93-like(LOC101489960;FC:4.1↑)、bHLH18-like型(LOC101507246,FC:3.2↑)和bHLH18-like型(LOC101507557;FC:3.0↑)，而敏感基因型仅诱导bHLH93-like(LOC101489960;FC:2.3↑)。此外，耐旱基因型在VS和RS均表现为C2C2-DOf(LOC101496410、LOC101512379、LOC101496410)、MYB(LOC101500866、LOC101509066、LOC101503477、LOC101490969、LOC101500181)和BTB/POZ及TAZ结构域蛋白1(LOC101498955)表达上调。
4. 蛋白激酶的基因表达
信号转导通路的基因表达涉及多种蛋白激酶，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、钙依赖蛋白激酶(CDPK)、SNF1相关激酶(SnRK)、受体样激酶(RLK)和CBL相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(CIPKs)。在本研究中，在VS(FC：1.9↑)和RS(FC：2.2↑)耐旱基因型(ICC8261)中，有丝分裂原激活的蛋白激酶1样蛋白激酶1(LOC101493066)在VS(FC：1.9↑)和RS(FC：2.2↑)中上调(图5)。CDPK5(LOC101512548， FC：1.4↑)和CDPK3(LOC101512470，RS的FC：1.1↑)等CDPKK家族成员在耐旱基因型中的表达增加(图5)。此外，耐药基因型(ICC82 6 1，Fc：2.5↑)和敏感基因型(ICC2 83，Fc：2.6↑)的CDPK4(LOC10 14 92)在RS中的表达均增加(图5)。RLKs家族如IMK2(LOC101502785)、CRK25(LOC101508862)和PERK4(LOC101511071)在VS耐旱基因型中表达上调，而PERK14(LOC101510818)和HSL2(LOC101509045)在RS中上调(图5)。此外，耐旱基因型中，在VS(FC：1.5↑)和RS(FC：1.9↑)处WAK20(LOC101515529)上调时，观察到了壁相关受体激酶(WAKs)的差异调节(图5)。在敏感基因型中，CIPK1样蛋白(LOC101510187)的表达在VS(Fc：−9.0↓)处特异性下调，而在耐旱基因型中在RS(Fc：1.3↑)处表达上调(图5)。
5. ROS分解系统
ROS被多种抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等分解。在本研究中，GST基因(LOC101514835、LOC101508320、LOC101503639和LOC101494097)在VS和RS的耐旱基因型中表达上调(图5)。过氧化物酶基因(LOC101510290、LOC101498384和LOC101512377)在耐旱基因型中表达上调。然而，在VS和RS的敏感基因型中观察到过氧化物酶47(LOC101498384)和类似过氧化物酶72(LOC101512377)的表达显著下调(图5)。此外，耐旱基因型的RBOHH(LOC101502622)和RBOHD(LOC101491892)的表达在VS时下调，而RBOHE(LOC101508393)和RBOHA(LOC101511451)的表达在RS时上调(图5)。
6. 转运蛋白家族基因分析
转运蛋白介导应激诱导的信号分子(如激素、离子和渗透压)的主动或被动转运。依赖ATP的转运蛋白如ABCB15-like(LOC101501233)、ABCB19(LOC101512893)和ABCC12-like(LOC101490063)在VS的耐旱基因型中上调，而ABCB15-like(LOC101489264)、ABCB29(LOC101493070)和ABCG22-like(LOC101494791)在RS上调(图6)。在敏感基因型中，这些转运蛋白的表达没有变化，甚至下降。此外，还研究了糖和硝酸盐转运蛋白基因的表达。双向糖转运蛋白N3(LOC101510607)、SWEET1-like(LOC101515250)和SWEET4(LOC101488443)在干旱胁迫期间在两个基因型中均上调(图6)。NRT1/PTR F amily3.1(LOC101498251)和NRT1/PTR FAMILY5.6-like(LOC101497328)在两个基因型的RS中均显著上调(图6)。水通道蛋白基因如PIP2-1-like(LOC101488859)和TIP2-2(LOC101505621)在耐旱基因型中分别在VS和RS上调(图6)。
7.根瘤发育基因
鹰嘴豆根含有有助于与固氮根瘤菌建立共生关系的根瘤。敏感基因型的结瘤受体激酶(LOC101507037)和钙/钙调素依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DMI3(LOC101513751)的表达在VS和RS均下调，而耐旱基因型仅在RS有轻微下调(图6)。与之相反，受体样激酶3(LOC101496137)和CLAVATA1(LOC101488348)在耐旱基因型的VS和RS处上调(图6)。
8.激素相关基因
植物激素控制植物的生长发育，也介导逆境反应。生长素合成基因吲哚-3-丙酮酸单加氧酶YUCCA2(LOC101489587)在敏感基因型的VS(FC：−4.3↓)处表达下调(图7)。相反，生长素反应因子(ARF19like；LOC101498659)参与生长素反应信号调节的基因在RS的耐旱基因型(FC：1.1↑)和敏感基因型(FC：1.4↑)中均上调。生长素反应蛋白(AUX/IAA)表现出基因型和发育阶段特异性反应，其中IAA26-like(LOC101496793)在VS(FC：1.2↑)耐旱基因型上调，IAA29(LOC101498854)在除RS敏感基因型(图7)外均上调。3个PIN基因，包括PIN1b(LOC101499345)，PIN1c-like(LOC101491826)和PIN4(LOC101502756)，在RS的耐旱基因型中下调(图7)。
细胞分裂素生物合成基因IPT5(腺苷酸异戊烯基转移酶5；LOC101499412)在VS的耐旱基因型中特异性下调，而在RS的两种基因型中上调(图7)。此外，调节细胞分裂素信号的AHP4(拟南芥组氨酸磷酸转移4；LOC101495485)在VS和RS分别在敏感基因型(ICC283；Fc：4.1↑)和耐旱基因型(ICC8261；Fc：3.5↑)中上调(图7)。此外，组氨酸激酶5AHK5(LOC101492661)在耐旱基因型VS中特异性下调(图7)。乙烯反应转录因子(ERF)如ERF1-like蛋白(LOC101511846)和ERF113-like蛋白(LOC101512295)在VS耐旱基因型中上调(图7)。此外，ERF13-like(LOC101491020)和ERF2-like(LOC101498159)基因在耐旱基因型中上调，而在RS敏感基因型中下调(图7)。ABA代谢基因NCED1(LOC101492033)在敏感基因型VS处上调，RS处下调。ABA受体复合体(PyR/PYL/RCAR)基因和蛋白磷酸酶2C(PP2Cs)基因在两种基因型中存在差异调节。ABA受体基因如类PYL4(LOC101508615和LOC101509736)在VS耐旱基因型中显著下调，而蛋白磷酸酶2c基因(PP2C；LOC101488329和LOC101506371)在敏感基因型中特异性上调(图7)。PYL4-like基因(Loc101508615)在抗性基因型(ICC8261,FC:1.1↑)和敏感基因型(ICC283,FC:-2.9↓)之间存在反向调节。
赤霉素3-β-双加氧酶基因(GA3ox；LOC101498534，LOC101498875)在VS耐旱基因型中表达下调(图7)。然而，类赤霉素20氧化酶(GA20ox；LOC101491937)在RTS和RS两个基因型中均上调(图7)。赤霉素受体类GID1B(LOC101492626)和Della(LOC101507839、LOC101508270、LOC101494454、LOC101513638)的表达在两种基因型的各个发育阶段均下调(图7)。茉莉酸途径基因在VS耐旱基因型中上调，而在敏感基因型(FC：−2.7↓；FC：−2.5↓)中下调(图7)。耐旱基因型在亚油酸9S-脂氧合酶同系物(LOC101491298和LOC101491624)的表达上表现出上调，特别是在VS和RS上(图7)。在VS(LOC101495051，LOC101503507，LOC101503456)和RS(LOC101492009，LOC101495051，LOC101488350，LOC101503456，LOC101491099)耐旱基因型中TIFY基因的表达增加(图7)。
讨论
1.不同环境因素影响植物的表型
本研究比较了两个不同鹰嘴豆基因型在营养生长(VS)、生殖过渡(RTS)和生殖(RS)阶段的表型和根特异性转录反应。耐旱基因型在干旱胁迫下具有较高的根系和地上部分干生物量，这可能与根系较强的吸水力和/或恢复机制的启动有关。耐旱基因型的根系长度和表面积在营养生长期较高，但在生殖生长期表现较为保守。而根系直径则表现出相反的趋势。更长的根有助于植物从更深的土壤中吸收水分，而更大的表面积为菌根定居提供了更好的机会，从而促进了养分的获取。根直径的相反反应可以用直径控制分配给根系的给定生物量的长度和表面积这一事实来解释。耐旱基因型的叶绿素含量在RTS干旱胁迫下更高，这表明提高了采光和能量生产能力，以支持生长和繁殖。正如之前的研究，耐旱基因型中较低的比叶面积可以提高水分利用效率。
2. 多个基因家族的TF上调可能会激活与抗旱性有关的胁迫反应基因
在本研究中，与各种生物学功能相关的基因在干旱胁迫下发生了改变。与ABA依赖性(ABI5)和ABA非依赖性(DREB1A和DREB1C)途径相关的转录因子(TF)基因在RS的耐旱基因型中表达上调，表明多个调控网络的强大诱导传递了抗旱性。WRKY家族转录因子在生物和非生物胁迫的适应中发挥作用，并调节胁迫反应信号和活性氧的产生。bHLH家族TF基因(VIP1、bHLH18-like和bHLH93-like)在耐旱基因型中上调，这些TF可能有助于增强防御。VIP1通过丝裂原活化蛋白激酶途径激活应激反应基因。总体而言，在耐旱鹰嘴豆基因型中TF的上调可能会激活与抗旱性有关的胁迫反应基因。
3.早期蛋白激酶高表达有助于抗旱性的提高
蛋白激酶是信号转导通路的组成部分，在应激反应通路的感知和激活中起着重要作用。在干旱胁迫下，耐旱基因型VS和RS的MKK1基因均上调，可能通过降低应激状态下的ROS水平而有助于维持细胞内环境的稳定。CDPKs通过细胞内Ca2+与最终调节下游靶标的钙调素样结构域结合而激活，其家族成员(CDPK-SK5、CDPK3和CDPK4)在两种基因型中均上调。PERK4通过ABA信号调节根尖的生长，HSL2通过控制细胞分离来调节侧根的出现，RLKs(IMK2、CRK25和PERK4)在VS的耐旱基因型中表达上调，而PERK14和HSL2在RS的两种基因型中都表达上调。这些激酶在耐旱基因型中的表达增强可能有助于细胞壁的松动，从而最大限度地减轻干旱对根生长的抑制。综上所述，胁迫早期大量蛋白激酶上调可能通过激活下游的胁迫信号通路而有助于抗旱性的提高。
许多抗氧化酶如谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化物酶(PER)在耐旱基因型中表达上调。GST和PER的同时上调表明，干旱条件下多种ROS降解成分能有效地清除ROS，但它们在敏感基因型中的下调可能导致ROS的过度积累，从而导致根的生长受到抑制。耐旱基因型的RBOHH和RBOHD在VS时表达下调，而RBOHE和RBOHA在RS时上调。RBOHD和RBOHH的下调可能导致依赖于ABA的ROS信号的抑制，从而使耐旱基因型的根系生长受到边际抑制。因此，多个抗氧化酶的协同作用增强了植物的抗逆性。
应激诱导的信号分子通过主动或被动转运蛋白进行运输。糖转运蛋白(N3、SWEET1-like、SWEET4)和硝酸盐转运蛋白(NRT1/PTRF)在两个基因型中均上调。SWEET11以特定细胞类型的方式促进根的糖供应，并参与共生机制的建立。水通道蛋白被动转运水分子，本研究发现耐受基因型中PIP2-1-like和TIP2-2表达上调，可将水通道蛋白作为提高鹰嘴豆抗旱性的理想靶标。
4. 复杂的激素调节影响鹰嘴豆的根系生长
在本研究中，生长素生物合成基因(YUCCA2)在VS的敏感基因型中表达下调，表明生长素生物合成减弱。与此相一致的是，在敏感基因型中观察到了对根生物量、长度和表面积的抑制。在耐旱基因型中，整合乙烯和茉莉酸信号通路并参与应激反应的乙烯反应转录因子(ERF)如ERF1、ERF113、ERF13和ERF2-like蛋白表达上调。耐旱基因型的茉莉酸生物合成基因LOX、LOX同源物和TIFY/JAZ的表达显著上调，表明该基因型的茉莉酸产量较高。激活参与茉莉酸生物合成的丙二烯氧化物合成酶(AOS)可以增强鹰嘴豆的抗旱性。JA和ABA途径还参与调节气孔的打开和关闭，以提高抗旱性。总体而言，在干旱胁迫下，复杂的激素网络控制鹰嘴豆的根系生长。
结论
干旱引发鹰嘴豆根中基因型和发育阶段特异的转录重编程。耐旱基因型特异上调与转录调控相关的基因(ERF113、ERF1、ERF13、VIP1、bHLH18、ABI5、CDF2、CDF3-like、DREB1A、DREB1B-like 00、MYB46、MYB114-like、WRKY33和RVE7)、激酶活性(MAPK MKK1、CPK3、PERK4、HSL2和CIPK1)和氧脂生物合成(LOX)，从而使它们成为提高抗旱性的理想候选基因。此外，本研究还观察到了植物激素生物合成和信号基因的差异基因表达模式，突出了激素网络在形成最适合干旱胁迫条件的根系表型方面的可能作用。总体而言，这项研究确定了与干旱胁迫适应有关的关键基因，对培育具有气候适应性的鹰嘴豆品种具有广泛的意义。
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