编译：石石，编辑：十九、江舜尧。
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导读
CYLD是一种著名的抑癌基因，在乳腺癌、结肠癌和恶性黑色素瘤等多种肿瘤类型中均下调。CYLD在人黑色素瘤细胞中被转录抑制因子SNAIL 1所抑制，从而增加细胞的增殖、侵袭和迁移潜能。该抑癌基因具有独特的功能，研究者构建了新的小鼠模型TG(Grm 1)CYLD-/-。在此，研究者证明CYLD缺乏症会导致黑色素瘤的早期发病和加速肿瘤的发生。首先，RNA测序数据揭示了CYLD在调控涉及增殖、迁移和血管生成的基因中的潜在作用。用TG(Grm 1)CYLD-/-和TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠原发和转移黑色素瘤细胞株进行的实验证实，CYLD的丢失促进了癌细胞的增殖和迁移，以及在体外的克隆原性。此外，通过管状形成试验、免疫组织化学和mRNA表达分析，研究者可以发现CYLD基因敲除可以增加血管生成模拟和(淋巴)血管生成。总之，研究者的发现揭示了CYLD在淋巴血管生成过程中的新功能方面，并证明了它在黑色素瘤进展的早期过程中的重要性。原名：Loss of CYLD accelerates melanoma development and progression in the Tg(Grm1) melanoma mousemodel译名：在TG（Grm1）黑色素瘤小鼠模型中，CYLD的缺失加速了黑色素瘤的发展和进展通讯作者：Anja-Katrin Bosserhoff通讯作者单位：德国埃尔兰根-纽伦堡大学生物化学研究所、解剖学研究所
CYLD的缺失加速了黑色素瘤的发生，促进了体内肿瘤的生长
为了研究CYLD在体内黑色素瘤发生中的作用，采用C57BL/6 CYLD基因敲除小鼠与TG(Grm1)小鼠杂交。然后对生成的TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−小鼠进行了发病分析。(图1A)。与TG(Grm 1)CYLD+/+对照组相比，TG(Grm 1)CYLD-/-小鼠发生黑色素瘤的时间明显提前。CYLD+/+小鼠在出生后18周出现肿瘤，而 TG(Grm1)CYLD−/−小鼠10周后已经观察到了。此外，在肿瘤发生后9周随访耳部、尾部和肛门黑色素瘤生长的进展情况。在这里，一个从最小到极端肿瘤生长的评分被用来量化黑色素瘤的进展。结果表明，与CYLD野生型小鼠相比，CYLD基因敲除小鼠的肿瘤生长速度增加(图1B)。此外，Grm1 mRNA在TG(Grm 1)C淋巴结组织中的表达将GYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−小鼠作为黑色素瘤细胞扩散的标记物。在此，77天龄的CYLD−/−小鼠淋巴结中Grm 1表达明显增强，而CYLD+/+小鼠则未检测到黑色素瘤细胞。为了明确CYLD依赖的解除管制基因及其导致CYLD基因敲除小鼠肿瘤生长增加的潜在机制，进行了RNA测序。Tg(Grm1)Cyld+/+与Tg(Grm1)Cyld−/−的原发性肿瘤组织用于确定基因表达谱。RNA测序显示，与野生型组织相比，CYLD基因敲除组织中有398个上调基因和101个下调基因。为了确定解除管制的基因对通路调控的影响，对差异表达的基因进行分析，并将其分类为GO项。KEGG路径的分类这些方法揭示了许多已知的癌症解除管制的途径，例如TGF-β和Rap1(表1)。在此，研究者使用Smad2/3响应报告基因测定证实了与CYLD-野生型细胞系相比，在CYLD-敲除中TGFbeta信号的上调(补充图。S2）。这是一致的有几种TGFβ靶基因如BMP2K或SMURF1的差异表达。有趣的是，根据生物过程进行的分类会产生细胞增殖、迁移和血管生成的调节。(表2)。在RNA测序结果的基础上，进一步了解CYLD在恶性黑色素瘤中的抑癌作用，并进一步了解tg(Grm 1)CYLD通配型和tg(Grm 1)CYLD-基因敲除鼠细胞株在恶性黑色素瘤中的抑癌作用。为此，从尾部和耳部分离出原发黑色素瘤组织的黑色素瘤细胞，以及淋巴结转移的黑色素瘤细胞（图1c）。由于所有细胞系在几代后色素沉着消失(图1d)，通过电子显微镜观察到所有被测细胞系的黑色素体，证实了黑色素细胞的起源（图1e）。此外，qRT-PCR分析显示，培养的TG(Grm 1)细胞系与小鼠小脑(阳性对照，设为1)具有相当的Grm 1 mRNA表达水平，而小鼠b16黑色素瘤和黑色素A细胞株(阴性对照)Grm 1却表达极低(图1F)。此外，GRM 1在CYLD-野生型和CYLD-基因敲除细胞系中的表达是相当的。这表明，具有相同遗传背景的GRM1产生的细胞携带并表达由dct启动子控制的Grm 1转基因，因此它们具有黑素细胞起源。图1 黑色素瘤在体内的发生和进展以及TG(Grm 1)黑色素瘤细胞系的产生。1a:黑色素瘤发病于TG(Grm 1)CYLD−/−(n=15)和TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠(n=18)。1b:肿瘤发生后CYLD基因敲除小鼠与CYLD野生型小鼠的肿瘤进展比较。评价尾部、耳部和肛周区肿瘤生长进展的分级系统在肿瘤发作后的9周内，如前面所述1c. 从TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−小鼠中分离培养小鼠原发黑色素瘤(耳、尾)黑色素瘤细胞及转移性黑色素瘤组织(淋巴结)。1d: 在几个通道之后观察到细胞系的色素沉积损失。1e: 用透射电镜观察原发肿瘤细胞株和CYLD+/+和CYLD−/−小鼠转移细胞系的球体，可见黑色素小体(箭头)。1f: 用qRT-PCR法检测10株TG(Grm 1)细胞株Grm 1 mRNA的表达，并与小鼠小脑对照(设置为1)进行比较。使用Melana和B16作为阴性对照，β-actin作为参考基因。1g: 采用western blot方法检测CYLD蛋白水平，确定CYLD基因型。以GAPDH为加载对照。(*p<0.05)CYLD-缺乏症可促进黑色素瘤细胞株的增殖、集落形成和迁移在从TG(GRM1)CYLD-野生型和TG(GRM1)CYLD基因敲除小鼠中产生黑素瘤细胞系后，用体外功能分析法对细胞进行鉴定。首先，使用XCELLigence系统体外实时增殖试验测量增殖，这一分析表明，转移性tg(Grm 1)CYLD−/−细胞与原代肿瘤细胞相比，其倍增时间明显缩短，而原代肿瘤细胞的增殖潜能则明显降低，而有或不表达CYLD的原发肿瘤细胞的增殖潜能是基本相当的。(图2A)。b.与TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠细胞系相比，原发肿瘤和转移性TG(Grm 1)CYLD−/−细胞的迁移明显增加。c.用TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−系统对原发黑色素瘤组织(PT)和转移淋巴结(LN)细胞进行了分析(细胞指数=测量阻抗的相对变化以表示细胞状态)。d.在克隆形成分析中，分别显示了两种基因型的每一个尾部和淋巴结细胞系的代表性图像，并对其进行了定量分析。(*p<0.05)对高转移倾向的黑色素瘤细胞其迁移潜力进行了分析，与TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠细胞系相比，原发肿瘤和转移性TG(Grm 1)CYLD−/−细胞的迁移明显增加 (图2B)。可以看出细胞贴壁不受CYLD的影响(图2C)。此外，对克隆形成潜能的分析表明，与CYLD相比，原发肿瘤和转移性CYLD缺陷TG(Grm 1)细胞的单个细胞形成集落的能力增强。CYLD的丧失加速了血管生成的过程，并促进了(淋巴)血管的生成。由于血管生成模拟实验是黑色素瘤的一个众所周知的特征，本文分析了CYLD对黑色素瘤细胞形成血用原发黑色素瘤和黑色素瘤转移的小鼠细胞系进行试管形成试验(图3A)。所有的TG(Grm 1)CYLD−/−细胞株都能构建出血管结构管的影响。为了更详细地描述这一有趣的差异，研究者研究了CYLD缺乏症对血管生成的影响。研究显示，TIMP2(金属蛋白酶2的组织抑制剂)、TIMP3(金属蛋白酶3的组织抑制剂)和ADAMTS5(一种去集成素和金属蛋白酶与凝血酶)的表达Ospin1型基序，5)减少黑素瘤细胞中的血管生成。因此，对这些抗血管生成标记物的mRNA表达模式进行了检测。虽然差异不显著，但TG（Grm1）Cyld-/-细胞株与TG（Grm1）Cyld+/+细胞相比，每个标记的表达较弱（图3b）。除血管形成外，尤其是淋巴管生成在黑色素瘤进展中也具有特别重要的意义。黑色素瘤细胞主要通过淋巴管转移到淋巴结中研究者旨在了解CYLD在此过程中调制的相关因素。首先，研究者利用特异性淋巴组织Lyve-1，（即一种特殊的淋巴管内皮标记物），通过免疫荧光染色，研究了CYLD在小鼠TG(Grm 1)CYLD+/+和CYLD−/−黑色素瘤组织中淋巴管形成中的作用（图3c）。定量分析显示，与CYLD-野生型小鼠相比，CYLD缺陷小鼠的黑色素瘤组织中淋巴管的数量显著增加，表明CYLD可能是黑色素瘤淋巴血管生成的调节因子。用定量RT-PCR方法检测了已知基因的mRNA表达模式淋巴管形成标记物在痣和肿瘤组织中的模型(图3d)。这提示CYLD缺陷小鼠痣组织中VEGF-C、podoplanin、Lyve-1和Prox-1 mRNA表达增加。虽然在肿瘤组织中只有Lyve-1的表达明显上调，CYLD丢失后几乎所有标志物都有较高表达的显著趋势，这支持CYLD在调节淋巴管生成中的作用。图3 CYLD丢失增强血管生成模拟和(淋巴)血管生成管状形成实验显示，在CYLD−/−细胞中形成血管结构的能力增强。通过QRT-PCR分析发现，与CYLD野生型细胞相比，CYLD缺陷细胞株中抗血管生成标记Adamts 5、TIMP 2和TIMP 3的mRNA表达降低。本研究建立小鼠模型，研究CYLD缺乏症对黑色素瘤的影响。该模型是在TG(Grm 1)黑色素瘤小鼠模型的背景下产生的，该模型显示了自发黑色素瘤的发展。众所周知，CYLD在人类黑色素瘤中具有抑制肿瘤的作用。以前的研究，包括研究者小组的研究，能够将CYLD的丢失与体外增殖、侵袭和体内肿瘤的进展联系起来。然而，有一些出版物报道说，CYLD在人黑色素瘤细胞中的重新表达的迁移潜能减弱了。一项研究描述了用siRNA治疗CYLD表达的黑色素瘤细胞时迁移减少的情况，此外在淋巴管血管生成过程中，CYLD在转移中的作用很差，之前未对其进行分析。RNA序列分析显示，CYLD缺陷型和野生型小鼠黑色素瘤的发生有很大的差异，发现CYLD缺陷型黑色素瘤组织中有许多解除管制的基因。有人证明，通过抑制转化生长因子-β信号在纤维化过程中发挥负调节作用。通过对RNA-seq数据分析，证实了CYLD与转化生长因子-β信号的联系，并通过在CYLD基因敲除与CYLD野生型细胞和组织中显示较高的β途径活性和SMAD靶基因的表达来证实了两者之间的联系。结果分析进一步证实了CYLD在调节增殖和迁移方面的相关性，就像在人类黑色素瘤中已经描述的那样。然而有趣的是，这也为CYLD在血管生成中的重要作用提供了初步线索，即由已有血管形成的新血管。根据RNA序列测定数据，用新产生的TG(Grm 1)黑色素瘤细胞株进行体外研究，发现CYLD基因敲除细胞株具有较强的增殖、迁移和克隆原性。这些数据与先前发表的人类黑色素瘤细胞系的结果一致，同时也证明了所产生的细胞株是CYLD肿瘤抑制功能未来研究的有效模型。血管生成是黑色素瘤中一个被广泛研究的过程，它可以帮助肿瘤保证营养和氧气的供应，并促进转移。黑色素瘤患者多项血管生成因子升高，血管生成率高与黑色素瘤患者预后差有关。众所周知，黑色素瘤细胞具有血管模拟的内在能力。在这项研究中，研究者发现结论：CYLD通过抑制肾小管的形成，对黑色素瘤细胞的血管生成具有调节作用。矛盾的是，另一项研究结果显示：CYLD表达的下调对内皮细胞的形成和萌发有一定的抑制作用。这种差异提示CYLD在不同的细胞类型中具有特定的功能，并支持CYLD在黑色素瘤细胞血管模拟中的作用。 研究者的数据表明，CYLD的缺失可能通过抑制TIMP-2、TIMP-3和ADAMTS 5等多种抗血管生成因子的表达而导致黑色素瘤血管生成。TIMP3是血管内皮生长因子介导的血管形成的拮抗剂，ADAMTS 5可以抑制内皮细胞的形成。TIMP 2可降低小鼠黑色素瘤细胞株B16的成管能力。此外，TIMP-2在食管癌中的表达与淋巴结转移呈负相关，其机制可能是通过抑制MMP的表达而实现的。有趣的是，包括VEGF-A与野生型CYLD相比，一种催化活性的CYLD(CYLD C/S)的重新表达并没有导致血管生成因子水平的降低。此外，只有CYLD的过度表达才能降低人鳞状细胞癌的血管生成。因此，CYLD的脱泛素酶功能显得尤为重要。来调节血管生成。研究表明，CYLD通过脱泛素酶功能参与了外膜成纤维细胞的转分化过程，从而在血管重构中发挥作用。研究者进一步询问CYLD是否也影响淋巴结构的形成。在先前的研究中，标记物Lyve-1的建立表明，大量淋巴管对一般的淋巴结转移和转移有预测作用。此外，淋巴管数量的增加与预后不良有关。有趣的是，CYLD敲除小鼠的黑色素瘤组织显示出比对照组更多的LYVE-1阳性血管，因此CYLD参与了淋巴血管生成的过程。这进一步证实了通过观察CYLD缺乏症可促进几种已建立的淋巴血管生成标记物的表达。值得注意的是，在研究者的研究中，CYLD缺陷小鼠的良性痣组织几乎所有研究指标的表达都显着增强。基于研究者的研究，CYLD的缺失正向影响黑色素瘤淋巴管的形成和转移，尤其是在黑色素瘤进展的早期过程中，是支持CYLD的重要作用。在血管生成和淋巴血管生成的背景下，通过分析对RNA测序数据的分析进一步支持了CYLD在这些过程中的作用。在测序数据中，有几条与癌症有关的途径和过程受到不同的调控，这些途径和过程与血管和淋巴管的形成有关。此外，体外数据也提供了强有力的证据，证明CYLD缺陷促进了已经被描述的参与血管紧张素过程的几个基因和信号通路的表达。在淋巴管血管生成方面也是如此。所有这些结果支持了研究者关于CYLD在淋巴/血管生成中的重要作用的假说。综上所述，新建立的小鼠模型及由此产生的原发肿瘤和转移细胞系为进一步研究CYLD在恶性黑色素瘤中的作用奠定了良好的基础。本文研究了CYLD在黑色素瘤血管生成模拟和淋巴管新生中的新功能。此外，研究者的研究结果显示了CYLD对黑色素瘤发病的重要影响，进展和转移，以及它的多种肿瘤抑制功能。
