科研 | Environmental Pollution：聚乙烯微塑料摄入影响斑马鱼（Danio rerio）发育
编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
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在过去的几十年里，塑料垃圾在地球环境中的不断累积，现已成为全球关注的环境问题。尽管传统上被视为一个宏观问题（即大的塑料碎片），但塑料污染问题在较小的范围内也很明显。相关研究表明，微塑料颗粒在环境中普遍增加。虽然这些小聚合物对海洋生物群的影响一直是一个重要的研究热点，但最近的全球调查表明，淡水湖泊和河流也受到微塑料的影响。然而，尽管有这些发现，目前对这些颗粒物对淡水动物，特别是脊椎动物物种的影响了解仍然有限。本研究的目的是评估高浓度的微塑料（5和20mg/L）在斑马鱼（淡水脊椎动物模型）早期生活阶段的影响。研究者将斑马鱼胚胎和幼鱼暴露在荧光标记的聚乙烯微粒中长达14天，并评估它们的微塑料颗粒含量、生长、孵化和耗氧率。然后通过RNA测序探究了斑马鱼响应微塑料环境的分子基础。在整个暴露过程中，研究者观察到鱼的胃肠道中以浓度依赖的方式不断积聚微塑料，但无法检测到这些微塑料对幼鱼发育、生长或代谢的任何有害影响。然而，整个动物的转录组学显示，在48小时内，微塑料诱导了幼鱼基因表达的短暂而广泛的变化，在14天内基本消失。然而，由于这些转录变化发生在幼鱼发育的关键时期，研究者认为有必要对这些颗粒的潜在长期影响进行评估。
论文ID
原名：Transcriptional effects of polyethylene microplastics ingestion in developing zebrafish (Danio rerio)
译名：聚乙烯微塑料摄入对斑马鱼发育的转录影响
期刊：Environmental Pollution
IF：5.714（二区）
发表时间：2018
通讯作者：Christophe M.R. LeMoine
实验设计
本研究的目的是评估暴露在原始聚乙烯微塑料中对斑马鱼发育生理的影响（即在孵化后的前两周内）。研究者将卵和幼鱼暴露在聚乙烯混合物中（10-45μm）。在随后的2周的微塑料（Microplastics，MP）暴露中，研究者监测了MP的累积、孵化率、死亡率、生长和代谢。此外，为了更好地了解MP暴露对预测的分子途径的影响，评估了暴露于不同MP剂量的2天和14天对整个动物的转录反应。总的来说，研究结果提供了一些关于微塑料对模型淡水脊椎动物物种的影响的见解，并且可以让研究人员更好地评估这种普遍存在的污染物的一些生理生态效应。
结果
早期发育：第一个实验是在高浓度的微塑料中以0dpf开始培育斑马鱼胚胎 (20mg/L）。已知许多有毒物质在发育胚胎和幼鱼中具有害作用，研究者监测了暴露于MP的斑马鱼的死亡率、孵化率和发育率。在荧光灯下定期检查未受损伤的胚胎表明，MP颗粒无法穿过绒毛膜。此外，在24小时内暴露于MP不会影响死亡率，并且在发育的前5天对孵化率没有实质性影响（图2）。考虑到斑马鱼绒毛膜孔的相对大小（<1μm），以及本实验中使用的MP颗粒的数量级较大（10-45μm），因此不影响孵化前的胚胎。此外，最近对小到足以穿透绒毛膜的原始塑料纳米颗粒的毒理学效应研究发现这些颗粒对胚胎早期死亡或孵化成功的影响很小，因此似乎纳米/微塑料整体对斑马鱼最早生命阶段的影响微乎其微。
MP积累与幼鱼生长：在发育的前5天，研究者继续对幼鱼进行监测，以评估它们开始积累MP的发育点。广泛筛选（约9个板，70个胚胎/个）表明斑马鱼幼鱼只开始积累微珠在约5dpf，与开始在这个物种的外源性喂养一致。鉴于这些观察结果，以下一系列MP暴露开始于5dpf，然后转移到能够获得外源食物的幼鱼饲养烧杯中。有趣的是，在多个实验中，注意到在观察到的所有发育阶段（5-19dpf），MP只存在于鱼的胃肠道中（见图1）。这与使用纳米塑料的研究形成对比，后者表明塑料在多个组织中积聚。然而，可以将这种差异归因于MP的大小差异，因为本实验中的MP在μm水平，因此不太可能穿过上皮膜。有趣的是，另一项研究表明，在成年斑马鱼中，同样大小和浓度的MP不仅在内脏中积累，而且在鳃组织中也积累，研究者在任何处理中都没有观察到。这可能是由于幼鱼和成年斑马鱼鳃的基本生理差异，斑马鱼鳃直到14DPF（在实验结束时)才完全发挥作用。因此，这两个生命阶段之间积累的差异可能是由于暴露于功能性鳃的时间相对较短（5天），以及在整个个体发育过程中，特别是幼鱼和成年鱼之间，鳃的功能和依赖性发生了很大变化。
当斑马鱼在5dpf暴露于MP时，研究者观察到动物中MP的剂量依赖性累积（图3）。实际上，在每个取样点记录到的荧光量，20mg/L处理组是5mg/L的两倍。而且在最高剂量下，鱼不会积累更多的颗粒，并且是“饱和的”，或者可能表明荧光分析本身的局限性。然而，结果表明，斑马鱼幼鱼持续摄取MP，但由于缺乏时间尺度上的积累，它们完全有能力排出MP。许多种类的脊椎动物和无脊椎动物与斑马鱼类似，能够控制MP的分泌，从而防止肠道阻塞和其他胃肠道功能障碍。
研究者监测整个暴露期间幼鱼的生长和存活率，这两个重要的生理变量在这一关键时期的发展。总的来说，1dpf后的存活率在98%以上，并且在任何处理之间没有差异。幼鱼体型大小预计会随着幼鱼年龄的增长而增加，但两种处理之间似乎没有任何差异（图4）。关于MP对幼鱼发育影响的报道很少，根据实验设计、种类和研究中的MP，结果各不相同。例如，虽然MP对斑马鱼幼体的宏观影响似乎很小，但暴露于MP的幼体鲈鱼死亡率随着MP剂量的增加而增加，但其生长率同样未受影响。相比之下，MP对海胆幼鱼的生长和存活影响有限，而对腹足类红鳞鱼幼鱼的生长有负面影响。
呼吸测量:由于生长速度似乎相对不受实验条件的影响，研究人员推测幼鱼生理的其他方面，即新陈代谢，将受到肠道中MP积累的负面影响。事实上，如果MP的积累影响营养物质的吸收或GIT功能的其他方面，人们会期望能量平衡有一个不同的分配，也就是说，如果要保持生长速度，其他代谢支出应该减少。为了研究这一点，作者对实验中不同发育阶段的所有生长的幼鱼进行了全动物呼吸测定。从受精中获得的MP鱼在7dpf时的耗氧量有显著但短暂的减少（近50%）（图5）。这些影响似乎只是暂时的，因为耗氧率与对照组（12dpf）相比无显著差异（图5）。当斑马鱼从5dpf开始在MP水中饲养时，在整个发育期间的耗氧量没有显著变化（图5）。因此，MP暴露可能会影响一些MP处理的幼鱼的耗氧量。不同处理间的时间差异也许可以解释为，从受精中饲养的斑马鱼一旦开始外源性喂养（~5dpf）就可以开始摄入MP，从而表现出早期反应，采样可能错过了其他MP处理的时间窗。目前使用的呼吸测量系统可能并不能如实估计动物的常规代谢率，幼鱼有时在呼吸室内非常活跃。很少有研究使用呼吸测量法来评估MP对生理的影响，在桡足类动物中的一项研究表明MP对活性代谢率没有影响。
基因表达：高剂量的MP暴露似乎对发育中的斑马鱼幼体的各种生理特性几乎没有影响。然而，最近在不同物种中的一些报告表明MP暴露具有分子效应。研究者探究了MP暴露对斑马鱼的分子基础。总的来说，MP处理的幼体主要在2天的时间点表现出显著的基因表达差异，而第14天的暴露产生了更少的DEG。GO注释结果显示，最显著的变化与脑发育、眼和感觉器官发育、胚胎和器官发育、胚胎器官形态发生以及头部发育等多种发育程序的下调有关。
在每种处理中，功能分析显示MP幼鱼中最显著的下调类别与中枢和外周神经系统有关。例如，与中枢神经系统各种结构（如乳头体、中脑、后脑和下丘脑）相关的发育基因受到显著影响（图6）。此外，MP暴露持续影响与正常神经发育（树突和神经发育）、突触功能（囊泡周期、囊泡介导的突触转运、突触组装）和整个神经过程（神经冲动的传递）相关的转录本（图6）。此外，5mg/L处理上，大多数上调类别与翻译、核糖体和剪接体功能有关，表明蛋白质合成过程增加（图6C）。研究者还进行了平行的David和GSEA分析，以证实这些结果。
神经系统：在所有受MP处理影响的通路中，大部分下调的DEG与神经系统有关（图6）。研究发现与神经元功能、神经元分化和轴突形成以及视觉相关分子相关的转录物平均有30%下调，但目前还不清楚MP影响鱼类神经生理学的机制。
代谢基因：在MP处理的鱼中，一些代谢基因始终受到影响。包括糖酵解途径（己糖激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶、醛缩酶）、嘌呤代谢（腺苷酸环化酶）、氧化代谢（ATPase）和赖氨酸代谢。对于这些基因中的大多数，MP处理之间的下调是一致的，在20 mg/L处理中有更强的作用趋势，表明MP处理鱼的细胞代谢途径发生了深刻的变化。在MP幼虫中至少有50%的与氮代谢相关的转录物和更具体的与尿毒症发生和转运相关的基因（氨甲酰磷酸合成酶III、鸟氨酸转氨酶、谷氨酰胺合成酶、水通道蛋白9b）上调。这些可能表明增加的蛋白水解促使MP暴露的鱼中的促生途径的更高活性。综上所述，MP处理的鱼（尤其是高剂量的鱼）表现出代谢基因表达的调节，并对多种代谢途径产生潜在的影响。
总结
微塑料污染在陆地、海洋和淡水环境中广泛存在，已经成为一个全球性的问题。大多数动物和每一个营养水平都可能受到这种普遍存在的污染物的影响。为了更好地了解微塑料对淡水脊椎动物的潜在影响，研究者将斑马鱼胚胎和幼体暴露在超生态浓度的聚乙烯MP中。研究结果表明，实验条件下，MP暴露对发育中的胚胎和幼体的短期生理水平影响很小。然而，在MP暴露后数千个基因表达发生短暂变化，但在2周后基本消失。原因可能是暴露发生在发育的关键阶段，实验动物以基本过程（如大脑和神经分化、新陈代谢）为目标，未发现MP暴露对动物后期的健康状况的影响。此外，在现实环境条件下，MP通常以更复杂的混合物的形式存在，因此有必要在更符合实际环境的条件下研究MP暴露对各个生命阶段的影响。以便更好地了解并应对微塑料的潜在威胁。