科研 | Chemosphere: 镉或铜暴露下幼年日本囊对虾的比较积累和转录组学分析（国人佳作）
编译：Mr. Left，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Comparative accumulation and transcriptomic analysis of juvenile Marsupenaeus japonicus under cadmium or copper exposure
译名：镉或铜暴露下幼年日本囊对虾的比较积累和转录组学分析
期刊：Chemosphere
IF：5.108
发表时间：2020.6
通讯作者：李健
通讯作者单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2020.126157
实验设计
结果
1 Cd和Cu的积累
与对照相比，日本囊对虾中的Cu和Cd水平在暴露后明显更高（p <0.05）（图1）。与对照相比，Cd的含量提高了约32倍（12.41 μg/g对0.38 μg/g）。Cu浓度为20.486 μg/g，而对照为0.42 μg/g。因此，日本囊对虾中的Cd积累比Cu高约1.67倍（p <0.05）。
图1 在对照条件下以及暴露于100 μg/L Cd或Cu之后，日本囊对虾中的Cd和Cu含量。数据表示为三个重复样品的平均值±标准偏差。与对照组相比，星号（*）表示Cd或Cu处理组的显著差异。＃表示在相同暴露水平下Cd和Cu之间的显著差异。
2 转录组测序和从头组装
暴露于Cd和Cu胁迫48小时后，整个生物体的转录组测序产生了561,673,852个原始数据，经过加工后，包括545,866,552个过滤后的测序数据，其Q30（Phred值> 30）值为93％（表1）。
使用Trinity进行剪接可生成76,726个转录本，范围从201 bp到27,065 bp。同时，获得了日本囊对虾共60,130个独立基因（201 bp至27,065 bp），平均长度为1134 bp，N50值为1809 bp（表2）。
|
Treatment |
Samples (Replicate) |
Total Reads |
Clean Reads |
Clean Bases |
Q30a (%) |
|
CK |
CK01 |
61,798,284 |
60,219,748 |
9,032,962,200 |
93.72 |
|
CK02 |
60,247,460 |
58,835,298 |
8,825,294,700 |
93.88 |
|
|
CK01 |
62,192,980 |
59,985,044 |
8,997,756,600 |
93.27 |
|
|
Cd |
Cd01 |
64,135,038 |
61,933,186 |
9,289,977,900 |
93.87 |
|
Cd02 |
61,696,154 |
59,480,098 |
8,922,014,700 |
93.78 |
|
|
Cd03 |
61,762,912 |
60,185,110 |
9,027,766,500 |
93.86 |
|
|
Cu |
Cu01 |
62,530,564 |
60,560,350 |
9,084,052,500 |
93.55 |
|
Cu02 |
63,273,570 |
61,859,570 |
9,278,935,500 |
93.74 |
|
|
Cu03 |
64,036,890 |
62,808,148 |
9,421,222,200 |
93.87 |
表1 所有样品的三份重复的序列数据的质量。
a：Q30表示碱基的百分比，每个碱基的测序准确性为99.9％。
|
Min Length |
Mean Length/bp |
Max Length/bp |
N50a |
N90a |
Total |
|
|
Transcripts |
201 |
1185 |
27,065 |
1883 |
2168 |
76,726 |
|
Genes |
201 |
1134 |
27,065 |
1828 |
2417 |
60,130 |
表2 转录本和独立基因的组装数据
a：N50/N90–数据按剪接转录本的长度从长到短排序，并且转录本的长度累积到不少于剪接转录本总数的50％/90％。
3 转录组的分类和功能注释
使用GO，KEGG，COG，Nr，SwissProt和Pfam数据库搜索了60,130个独立基因序列，生成了23,872（39.7％），20,447（34％），28,619（47.6％），30,238（50.29％），27,085（45.04％）和25,344（42.15％）个显著命中。共有34,608个独立基因（57.56％）与所有数据库匹配，并且Nr数据库生成了最多数量的带注释的独立基因（表3）。
|
All_Unigene number |
Percentage (%) |
|
|
GO |
23872 |
0.397 |
|
KEGG |
20447 |
34 |
|
COG |
28619 |
47.6 |
|
NR |
30238 |
50.29 |
|
Swiss-Prot |
27085 |
45.04 |
|
Pfam |
25344 |
42.15 |
|
Total_anno |
34608 |
57.56 |
|
Total |
60130 |
100 |
表3 具有注释成功率统计信息的七个数据库中的转录组数据。
GO，基因本体；KEGG，《京都基因与基因组百科全书》；COG，直系同源群集；NR，非冗余。
4 DEG鉴定
从（CK）-vs-Cd和CK-vs-Cu的比较中，分别鉴定出1802和2670个DEG（图2）。其中，在CK-vs-Cd和CK-vs-Cu的比较中均鉴定出851个DEG，它们代表了对两种应激源均应答的基因（表S2-1）。对于CK-vs-Cd的比较，鉴定了951个特定的DEG，它们代表了对Cd胁迫有特异性应答的基因（表S2-2）；鉴定出1819个DEG是对Cu胁迫特异反应的基因（表S2-3）（图2A）。大多数DEG在Cd或Cu胁迫下均被上调：响应Cd胁迫，上调了1074个DEG，下调728个，而在Cd胁迫下，1652被上调，而1018下调（图2B）。在对两种应激源均应答的851个基因中，有560个被上调，而291个被下调。
转录组学分析显示，对Cd和Cu胁迫均应答的基因中有很大一部分是与细胞骨架，免疫功能，抗氧化，解毒，糖代谢，HSP，MT，细胞凋亡和铁转运相关的基因（表S3–S9）。
图2 与对照组相比，暴露于Cd或Cu 48 h的日本囊对虾中的差异表达基因（DEGs）。（A）暴露于Cd或Cu的日本囊对虾所共有的DEG的维恩图。（B）暴露于Cd（CK_vs_Cd）或Cu（CK_vs_Cu）的日本囊对虾中上调和下调的基因数量。
5 DEG的GO和KEGG富集分析
对DEG的GO功能富集分析显示，GO注释显著富集了136个（对Cd和Cu胁迫均响应的基因），134个（仅对Cd胁迫响应的基因）和414个（仅对Cu胁迫响应的基因），校正后的p值<0.05（表S10）。对Cd和Cu胁迫均响应的851个DEG的GO分类显示，“角质层的结构成分”是最有代表性的生物过程，“结构分子活性”在细胞成分中很重要，“核糖核蛋白复合物”在分子功能中过表达（图3A）。对CK-vs-Cd组特异的951个DEG的GO分类显示，“膜的内在成分”是最具代表性的生物学过程，“膜元件”在细胞成分中很重要，而“几丁质结合”则在其分子功能中过表达（图3B）。对CK-vs-Cu组特异的1819个DEG的GO分类显示，“细胞大分子复合物组装”是最具代表性的生物学过程，“酰胺生物合成过程”在细胞成分中很重要，而“大分子生物合成过程”则在分子功能上被过度表达（图3C）。
KEGG通路分析的结果表明，可以注释189、231和300条通路，其中28、23和35分别显著富集了对Cd和Cu胁迫都有响应的基因，对Cd胁迫有特异响应的基因，以及对铜胁迫有特异响应的基因（表S11）。“核糖体”是在851个对Cd和Cu胁迫均响应的DEG中最富集的组（图4A）。“心肌收缩”是对CK-vs-Cd组特异的951个DEG中最丰富的途径（图4B），而“RNA转运”是对CK-vs-Cu组特异的1819个DEG中最丰富的途径（图4C）。
图3 差异表达基因（DEG）的基因本体分配。（A）特定于Cd胁迫的响应，（B）特定于Cu胁迫的响应，以及（C）特定于Cd和Cu胁迫的响应。
图4.差异表达基因（DEG）的京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析。（A）特定于Cd胁迫的响应，（B）特定于Cu胁迫的响应，以及（C）特定于Cd和Cu胁迫的响应。
6 Cd或Cu暴露后所选DEG的表达模式分析
在本研究中，使用qRT-PCR分析评估了转录组测序结果的可靠性。研究者选择了对Cd和Cu胁迫均响应的16个DEG（两个与细胞骨架相关，五个与免疫功能相关，五个抗氧化相关，四个与解毒相关），两个对Cd特异性的DEG（HSP70和MT1）和10个对Cu胁迫特异性的DEG（HSP90，MT2，三个糖代谢相关，三个细胞凋亡相关和两个离子转运相关），进行qRT-PCR分析。与对照组相比，在对Cd和Cu处理组均反应的DEG中MHCT2，Crustin，C型凝集素X2，血蓝蛋白1，整合素5，NOS，Cu-Zn SOD，GPx3，NADH1，多聚泛素，UCE E2，CYP2，GST，ABC C5和ABC G9的mRNA表达水平增加，而β-肌动蛋白的mRNA表达下降。在响应Cd的DEG中，MT1的mRNA表达水平升高，而HSP70的mRNA表达水平降低。在响应Cu的DEG中，GPI，G6PDH X1，LDH，MT2，p53，细胞色素c，半胱氨酸蛋白酶3，Na-K ATP酶α和V-ATP酶B的mRNA表达水平升高，而HSP90的mRNA表达水平降低。这些表达模式与RNA-Seq实验的结果一致，证实了RNA-seq数据准确可靠（图5）。
图5 RNA测序（RNA-Seq）和定量实时逆转录PCR（qRT-PCR）之间的基因表达数据比较。（A）细胞骨架相关基因；（B）免疫功能相关基因；（C）抗氧化相关基因；（D）解毒相关基因；（E）糖代谢相关基因；（F）HSP90（热激蛋白90）和MT（金属硫蛋白）基因；（G）细胞凋亡相关基因；（H）铁转运相关基因。数据表示为三个重复的平均值±标准偏差（S.D.）。每条上带有星号表示p <0.05的统计学差异。
讨论
甲壳类对重金属污染敏感。在河口和沿海地区，镉和铜是常见的重金属污染物。然而，在虾和其他水生非模式物种中，由于缺乏基因组信息，Cd和Cu诱导的分子反应在很大程度上是未知的。在本文中，高通量RNA测序技术和生物信息学分析用于研究日本囊对虾对Cu或Cd胁迫的全基因组全身转录组响应。我们从头组装了60130个独立基因，其中带注释的34608（57.56％）。因此，有42.44％的独立基因未通过BLAST检索进行注释，这可能是由于公共数据库中甲壳类和相关物种参考序列的数量有限所致。以前关于日本囊对虾的转录组分析也报告了高比例的未注释序列。未注释的独立基因可能代表候选新基因。
结果表明，在相同的暴露剂量下，对Cd和Cu的生物累积和转录组响应存在显著差异。比较转录组学鉴定了几个与细胞骨架，免疫功能，抗氧化，解毒有关的基因，它们对两个应激源都有反应。但是，我们注意到两组之间在热休克蛋白，金属硫蛋白，糖代谢，细胞凋亡和铁转运方面的生理差异。日本囊对虾对环境应激源的生理反应差异表明，应对不同应激源需要采取不同的策略。
1 日本囊对虾中镉和铜的生物积累
暴露后日本囊对虾显著积累了Cd和Cu。日本囊对虾中Cu或Cd的平均浓度分别为239.4和334.1 μg/kg。在相同的暴露浓度下，日本囊对虾中的Cu含量约为Cd的1.67倍，这表明日本囊对虾对不同金属污染物的反应可能采用不同的积累机制。值得注意的是，日本囊对虾的Cd2+和Cu2+的96 h 50％致死浓度分别为3.43 mg/L和1.74 mg/L，这表明日本囊对虾对Cd的耐受性比Cu高。在成年的Macrobrachium lanchesteri和幼年脊尾白虾中，Cd的96 h LC50值远低于Cu，与我们的结果相反。这种明显的差异可能是由于物种差异，试验动物的不同生命阶段以及其他非生物因素造成的。总体而言，本研究和其他研究的结果表明，需要进一步研究Cd或Cu毒性的调节机制。
2 响应Cd或Cu挑战的相同DEG和通路
在当前的研究中，有851个DEG（上调560个，下调291个）对Cd和Cu的暴露都有响应。GO富集散点图表明“角质层的结构成分”是最重要的生物学过程，而KEGG富集散点图表明核糖体通路最为重要。这些与Cd和Cu有关的DEG与各种应激反应，氧化还原电势控制，跨膜转运，转录调节，信号转导以及大分子的生物合成和代谢有关。我们的研究结果与先前的研究相似，表明金属/非金属应激刺激了甲壳类动物体内解毒的基因，例如，涉及转运，液泡隔离，信号转导，硫醇化合物结合和抗氧化剂清除的基因。
在显示出的Cd或Cu暴露响应最大的基因中，与细胞骨架相关的基因（表S3），包括与细胞骨架重塑有关的基因，如肌动蛋白，肌球蛋白重链和微管蛋白，它们在Cu或Cd暴露后被过度表达。Sinha等人（2014年）假设，细胞骨架重塑相关基因表达水平的变化很可能可以预防胁迫。结果表明，对重金属胁迫的反应涉及细胞骨架的重塑。然而，这些基因如何参与细胞骨架重塑应在以后的研究中探索。
在无脊椎动物中，保护有机体免受微生物感染和环境胁迫的唯一防御机制是先天免疫系统。通常，免疫系统对环境胁迫敏感，例如重金属毒性。在甲壳类动物中，先天性免疫系统会部署重要的抗菌成分，例如溶菌酶，克鲁斯汀和整合素，以对抗病毒和细菌感染。软体动物和节肢动物的血淋巴都含有血蓝蛋白，一种胞外巨型含铜糖蛋白。镉或铜胁迫会破坏甲壳类动物的免疫防御系统。本研究的结果表明，某些已知的免疫相关基因的表达水平响应于Cd或Cu胁迫而发生了显著变化，例如Crustin，凝集素，溶菌酶，几丁质酶2，血蓝蛋白，丝氨酸蛋白酶抑制剂，整合素和一氧化氮合酶。该结果与先前的报道一致，即在克氏原螯虾中，在Cu或Cd胁迫下可诱导免疫相关基因。
抗氧化剂系统涉及泛素介导的蛋白水解途径（UMP），而受损蛋白和调节蛋白的降解涉及泛素-蛋白酶体途径（UPP）。氧化应激使泛素化酶失活，从而导致泛素化系统受到抑制，蛋白酶体失活，并降低了细胞中泛素结合物的水平。在我们的研究中，观察到许多与UPP和UMP相关的基因在暴露于Cd或Cu之后被上调或下调（表S5），这表明抑制或激活泛素结合酶和蛋白酶体可能在维持氧化应激中起关键作用。结果与Zhang等人（2019）报道的结果相当，后者发现当受到Cd攻击时，淡水螯虾克氏原螯虾中泛素和蛋白酶体相关的基因表达发生了变化。
在甲壳类动物中，对环境胁迫的抗性通常涉及细胞内氧化还原稳态。在虾中，通过暴露于Cd和Cu时增加ROS产量，氧化应激会增加，从而导致对主要细胞大分子（如脂质，DNA和蛋白质）的显着破坏。为了对抗Cd和Cu的毒性，ROS刺激了抗氧化酶系统，包括铜/锌超氧化物歧化酶，过氧化物酶，硫氧还蛋白，NADH脱氢酶，以减少氧化应激所造成的损害。本研究的结果表明，暴露于Cd和Cu之后，各种过氧化物酶和氧化还原酶类的基因表达水平发生了显著变化（主要是上调）（表S5）。这表明抗氧化剂相关的酶上调对于清除细胞内ROS至关重要，并且这些酶可能协同作用以减轻氧化损伤，这强调了在暴露于Cu和Cd水平升高的水稻根细胞中维持氧化还原平衡的重要性。因此，这些基因可能参与抗氧化反应，并可能在Cu或Cd胁迫期间被开发为甲壳类动物的生物标记。
Cd或Cu暴露组中的共同调控途径包括“药物代谢-细胞色素P450”和“ABC转运蛋白”。因此，日本囊对虾中可能存在类似的对重金属胁迫作出反应的解毒途径。解毒是应对重金属胁迫的重要适应策略。异生物素的代谢涉及一组重要的酶，例如细胞色素p450单加氧酶（CYP）。CYP水解种生物素化合物以产生亲水性代谢产物。CYP家族也参与脂肪酸代谢。随后，代谢物与结合酶发生反应，称为II期代谢。异生物素的代谢还涉及重要的II期酶磺基转移酶和谷胱甘肽S转移酶（GST）。然后可以在III期代谢过程中通过ATP结合盒转运蛋白（ABC转运蛋白）将这些结合物从细胞中排出。在本研究中，发现CYP2，GST，SULT，ABCC和ABCG在Cd和Cu处理组均被诱导，这表明I，II和III期代谢对于Cd和Cd的解毒和排泄很重要。
3 响应Cd或Cu挑战的不同DEG和通路
转录组结果表明，951 DEG（516上调和435下调）对Cd胁迫有特异响应，1819 DEG（1092上调而727下调有727）对Cu胁迫有特异响应。Cu暴露比Cd暴露对更多DEG的表达有显著影响。这与Kim等人（2014）报道的结果相吻合，在该结果中，Cu在日本虎斑猛水蚤中比Cd具有更强的氧化应激诱导剂。结果还表明，上调的DEG比下调的DEG多得多。该结果与先前的研究相似，在先前的研究中，淡水螯虾克氏原螯虾中的Fe（III）胁迫导致DEG上调多于下调。这些结果表明重金属诱导基因表达，这可能损害生物学功能。此外，在Cd胁迫下的淡水虾罗氏沼虾中，DEG的上调多于下调，这表明日本囊对虾器官在不同的外部刺激下具有不同的作用。
葡萄糖作为一种基本营养素，可以提供能量并在整个机体中维持生理功能。6-磷酸葡萄糖异构酶（GPI）是一种二聚酶，可催化D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸的相互转化。在磷酸己糖支路或磷酸戊糖途径中，关键酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）。对于糖酵解和厌氧糖酵解途径，乳酸脱氢酶（LDH）发挥着重要作用。G6PDH，LDH的活性或表达水平发生变化，可能导致葡萄糖代谢紊乱并显示毒性应激。响应于铜胁迫，一些关键的糖代谢相关基因，包括GPI，G6PD和LDH，被特异地显著上调。该观察结果得到先前研究结果的支持，该研究表明Cu胁迫显着影响了大乳头水螅中的糖代谢。需要进一步研究铜对葡萄糖激酶调节的各种分子机制的影响。
虾或其他水生生物的胁迫可能导致异常的蛋白质形成和聚集，从而导致热休克蛋白（HSP）的诱导。HSP包含一类进化上保守的分子伴侣，可帮助蛋白质的折叠，组装，易位和降解。HSP包括HSP100，HSP90，HSP70，HSP60和小分子sHSP系列。其中，HSP70是最丰富，最保守和分析最多的。HSP70抑制重要的氧自由基相关酶的产生，导致内源性过氧化物酶（例如SOD）的直接释放并增加其产生。在本研究中，HSP70的表达由于铜和镉的暴露而显著降低（p <0.05）。相比之下，仅Cu处理导致HSP90表达下降。结果表明，解毒过程涉及HSP70和HSP90。完全相同的结果，即响应Cd或Cu暴露而下调HSP70；铜暴露后克氏原螯虾中HSP90表达的诱导和诱导。
当细胞内金属水平增加到超出正常代谢功能所需的浓度时，称为金属硫蛋白（MTs）的普遍存在的金属螯合小分子蛋白质将被调用进行重金属解毒，因为它们对Cd和Cu具有很高的结合能力。在结构上，MT分为两种主要的亚型（MT1和MT2）。镉可诱导大多数MT-1蛋白。而铜诱导大多数MT-2蛋白。与以前的研究结果相似，在本研究中，MT-1被Cd胁迫特异性上调，而MT-2表达被Cu胁迫特异性上调。Cd和Cu在脊尾白虾中强烈诱导了蚤状溞中Cd诱导的MT1（Cd-MT1）和Cu诱导的MT2（Cu-MT2）基因，这与此处的表达谱一致。这些结果表明，Cd-MT1和Cu-MT2的上调可能是Cd或Cu解毒反应的一部分。
多细胞生物将细胞凋亡作为维持细胞增殖与死亡之间动态平衡的必要生理过程。镉和铜都诱导细胞凋亡。Cu通过p53依赖性和独立途径诱导肝细胞凋亡，这表明Cu诱导的肝毒性可能严重涉及细胞凋亡疾病。但是，几乎没有机制信息可用于无脊椎动物。中华绒螯蟹暴露于Cu导致半胱氨酸蛋白酶3、7、8活性显著增加。此外，白虾暴露于1-5 mg/L Cu会导致半胱氨酸蛋白酶3的上调和血细胞凋亡的抑制（IAP）。我们的结果表明，Cu处理组中内在凋亡通路相关基因p53，IAP，细胞色素c（Cyto c）和半胱氨酸蛋白酶3均显著上调，而Cd处理组中未观察到表达变化。转录组分析表明，强大的细胞凋亡诱导作用可能在日本囊对虾耐受Cu胁迫的能力中起着核心作用。综上所述，这些结果表明，经由线粒体途径的半胱氨酸蛋白酶依赖性细胞凋亡可能有助于Cu诱导的日本囊对虾的应激。然而，Cu通过日本囊对虾的线粒体途径诱导的细胞凋亡的确切机制需要进一步研究。
离子调节机制的破坏也引起细胞损伤。可以通过Cu修饰涉及Na+，K+-ATP酶和V型ATP酶通道的离子调节网络。我们的结果证明了在铜胁迫下Na+，K+-ATP酶和V型ATP酶表达的下调。胞外离子调控的失衡对Cu的排泄有负面影响，这可能解释了为什么日本囊对虾中的Cu积累高于Cd。或者，Cu的积累将引起细胞凋亡应激。总体而言，这些发现表明，转运蛋白Na+，K+-ATP酶作为日本囊对虾中Cu进入的重要途径，是Cu积累的主要机制的一部分。
结论与展望
本研究是首次使用RNA-Seq来确定日本囊对虾转录组以鉴定暴露于Cu和Cd后解毒机理的异同的第一个报告。在确定的信号转导途径和DEG中，大多数DEG响应重金属暴露而被上调。这表明增加的基因表达可能诱导受损的生物学功能。另外，考虑到许多DEG参与糖代谢，氧化防御和免疫功能，可以在转录水平上通过增加解毒相关基因和免疫相关基因的表达来抵消Cd或Cu在日本囊对虾中的毒性。此外，转录组分析分别在暴露于100 μg/L Cd和Cu 48 h后鉴定出1802和2670个DEG，这表明Cu在日本囊对虾中比Cd具有更强的氧化应激诱导作用。但是，要确定甲壳动物中多金属/非金属应激适应的策略，需要进一步研究这些基因的个体功能和协调功能。
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