人HCT116细胞PSME3基因敲除构建方法

通过电转法介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结肠癌细胞HCT116的human PSME3基因。电转后挑单克隆，并通过PCR及测序验证，成功获得human PSME3基因敲除的纯合细胞。

1、gRNA设计：

gRNA位点1：ATACGCTACCTAACATGGCTGGG；
gRNA位点2：CCAGCATGCAAAATACAATGGGG

2、引物合成及质粒构建：

3、细胞转染及单克隆筛选

4、PCR及电泳鉴定：

鉴定策略的原理如下：

5、测序鉴定：

ATAAACAGAGGATTTAAGACTTTTGTTATGTTTTAGACGC-del；
1809bp--AGTGGCTAATGCCTGTAATCCCACCACTTTGGGAGGCCAA

6、克隆状态：

细胞检测结果：无菌、无支原体
培养体系：McCoy's 5A+ 10% FBS + 500μg/mL Hygromycin；1:3传代