还不会分子分型？这篇4+分文章学起来

Analysis of immune-related signatures of lung adenocarcinoma identified two distinct subtypes: implications for immune checkpoint blockade therapy通过分析肺腺癌免疫相关免疫特征确定两个亚型：免疫检查点阻断治疗的意义

一、背景介绍

  • PD-1/PD-L1是主要的免疫检查点之一，有抑制免疫系统的作用，因而作用于PD-1/PD-L1的面积检查点抑制技术（ICB）可以激活T细胞，逆转免疫微环境的抑制状态，减少肿瘤细胞免疫逃逸。PD-L1表达水平与ICB治疗效果正相关。

  • 肿瘤突变负荷（TMB）与ICB治疗效果正相关。

  • TIDE算法使用基因标志物对两个免疫逃逸机制——CTL失活和阻止CTL浸润进行评估，高TIDE评分表示肿瘤免疫逃避概率大，ICB治疗效果差。

二、分析流程

三、结果解读

1.LUAD有预后差异的亚型鉴定

作者在TCGA泛癌免疫文件中基于11篇免疫相关文章收集了2995个免疫相关基因。使用单因素Cox回归分析，以FDR<0.05为标准筛选到了433个OS相关基因。使用R包“NMF”对433个基因进行一致性聚类分析，1A为Cophenetic相关系数，离差，轮廓系数与聚类数的关系，n=2时聚类效果最好，因此分为两个亚型，使用R包“survival”对两个亚型进行生存分析，1B为两组的KM生存曲线，结果显示两组的生存差异显著，分别标记为高风险组与低风险组。1C为各因素与OS间的多因素分析森林图，排除年龄，性别，吸烟，肿瘤分期等临床变量影响后，高低风险分组可作为病人预后的独立影响因素。

图1.通过一致性聚类分析将LUDA分为两个亚型

为验证结果准确性，在9个验证集中再次使用上述433个免疫相关基因进行一致性聚类分析，做出生存曲线。结果显示，9个验证集被分为同样的2个亚型，且两组的生存差异显著，HR range: 1.69 [95% CI: 1.29-2.21, Log rank P < 0.001] to  4.29 [95% CI: 2.14-8.65, Log rank P < 0.001]

图2.9个验证集中高低风险组KM生存曲线对波

2.两亚型的ICB治疗效果预测

作者使用TIDE算法，对TCGA LUAD 数据集中两个亚型进行评分，3A为两组TIDE得分的箱线图，高风险组TIDE评分显著低于低风险组，多因素分析森林图3B显示排除年龄，性别，吸烟，肿瘤分期等临床变量影响后，结果仍有统计学意义。使用同样的方法，在9个验证集进行检验，结果一致(3C)，表明高风险组病人对ICB治疗可能更敏感。

图3.两个亚型TIDE得分

3.两亚型PD-L1表达与TMB差异

作者比较了高低风险组PD-L1表达水平，4A,B为PD-L1在TCGA与验证集中表达水平的箱线图，高风险组表达显著高于低风险组，P=0.003(4A), 在9个验证集进行检验，7个结果一致（4B），其余两个因缺少PD-L1表达芯片，无法检测。然后，作者进一步比较了两组TMB，在TCGA LUAD 数据集中，高风险组病人TMB比低风险组更高（4C）。然后进行多因素分析做出森林图4D, 在纳入几个突变特征：年龄相关的5-甲基胞嘧啶脱氨基化(signature 1)，mRNA编辑酶APOBECA过度激活(signature 2)，吸烟相关的C>A 突变(signature 4)，以及一些DNA修复基因突变等因素后，结果仍然成立。且高风险组非同义突变负荷也更高（4E），综合说明高风险组的ICB治疗效果可能更好。

图4.两亚型的PD-L1表达与TMB差异以及它们与高低风险组的关系

4.高风险组功能特点

作者使用R包 limma 与DESeq2计算芯片数据与RNA-seq数据差异表达T统计量，将T统计量输入fgsea包进行基因富集分析。5A展示了两组信号通路的异常表达，高风险组病人细胞周期相关通路显著高表达，FDR < 0.001。5B为细胞周期检查点分子在两组的表达，高风险组细胞周期检查点分子表达上调，P< 0.001(5B), 这两点是导致高风险组病人预后差的重要原因。

图5.高低风险组相关功能

6.分型相关SMGs突变模式

作者使用MutSigCV算法鉴定显著突变基因（SMGs），需满足q < 0.1，在TCGA LUAD与细胞系百科全书中都表达，突变率>3%。最终作者确定了23个显著突变基因（SMGs）。使用多元逻辑回归分析SMGs突变率与亚型间的关系，其中TP53, NAV3, COL11A1，KEAP1 ，SMARCA4在高风险组更易突变，排除年龄，性别，吸烟，肿瘤分期等临床变量影响后关系仍然成立。此外，作者使用秩和检验与卡方检验比较两亚型间的连续变量和分类变量，高风险组病人多为男性，吸烟者，处于临床晚期阶段。

图6.TCGA LUAD数据集中高低风险组SMGs分布

小结

作者通过聚类分析将LUAD分为了两个有预后差异的亚型，按照生存预后分为高低风险组。对比两个亚型的TIDE得分，PD-L1表达, TMB，结果表明高风险组病人的ICB治疗效果更好。但由于数据从多个平台提取，且部分结果无验证集，结果可能存在偏差。

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