文献解读|单细胞测序揭示炎症性癌症相关成纤维细胞在膀胱癌中的作用
随着单细胞测序技术的不断更新和发展，其在解析细胞异质性、揭示微环境中细胞群体间的关系、追踪疾病发生发展等研究中越来越发挥重要的作用，尤其在肿瘤方面的应用越来越多，依托该技术发表了大量高水平的文章。今天，小编选了一篇经典的单细胞测序在肿瘤研究中的应用的文章，做了详细解读以供参考。
膀胱癌示意图
单细胞测序揭示膀胱癌相关成纤维细胞亚群的炎性作用
Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma
发表杂志：Nature Communications
（IF：12.121）
研究背景
膀胱癌（BC)是世界上最普遍的泌尿生殖系统恶性疾病之一，每年造成超过16.5万人死亡。本研究对膀胱癌及其癌旁样本进行单细胞转录组测序，绘制了膀胱癌肿瘤微环境（TME）图谱，并发现了治疗膀胱癌的可能靶点，此外，还研究了TME和膀胱癌分子亚型之间的关系，这些结果为膀胱癌的个体化治疗提供了理论依据。
主要结论
1. 单细胞测序和细胞类型鉴定
数据分析结果显示，52,721个单细胞分成8个群。利用群特异性的marker进行注释，分别为：上皮细胞（EPCAM+）、内皮细胞（CD31+）、两种类型的成纤维细胞（COL1A1+） 炎症癌症相关成纤维细胞（iCAFs，PDGFRA+）和myo-CAFs （mCAFs）（RGS5+）、B细胞（CD79A+）、髓系细胞（LYZ+）、T细胞（CD3D+）、肥大细胞（TPSAB1+）。
实验流程及细胞分群图
2.癌细胞表现出高度异质性
上皮细胞（EPCs）进一步可以被分为17个亚群，发现肿瘤患者的上皮细胞表现出特异的表达模式，这可能是由于CNV导致的。利用InferCNV进行CNV检测，发现CNVs在大多数肿瘤来源的EPCs中积累，并在亚群间表现出高度异质性。基于CNV分析，将上皮细胞分为4组：正常对照组、低CNV组、高CNV组、和未检测到CNV组。进一步分析发现有一系列基因在对照组和CNV未检测组中表达，但在肿瘤细胞（高CNV组）中几乎不表达，这些基因主要富集在免疫相关通路，特别是B细胞相关通路中。这些结果表明膀胱癌细胞可能通过下调免疫原性来逃避免疫检测。
上皮细胞（EPCAM+）重新聚类
3. 髓系细胞再聚类分型
髓系细胞进一步可以分为7个亚群，并且利用流式细胞仪证实了这些细胞亚群。单核细胞主要来源于正常粘膜组织，而肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在膀胱癌组织中富集。此外，这两种细胞的转录组似乎呈现出持续的变化，这表明招募到肿瘤区域的单核细胞被重编程为TAMs。对单核细胞和TAMs进行轨迹分析和RNA速率分析，都观察到了类似的现象。对单核细胞向TAMs重编程轨迹进行SCENIC分析发现，BACH1、MAFG和NFE2的motif活性下调，MAF、STAT1和STAT2的motif活性升高，这可能是导致M2极化的原因。这些结果为改变免疫微环境的形成提供了潜在的靶点。
骨髓源性细胞的重新分群分析
4. 在膀胱癌中鉴定到两种不同的成纤维细胞亚型
成纤维细胞（COL1A1+）进一步分为两种不同的类型。PDGFRA+成纤维细胞表现出多种细胞因子和趋化因子的强烈表达，包括CXCL12、IL6、CXCL14、CXCL1和CXCL2，这与先前在胰腺癌模型中报道的iCAFs相似，RGS5+成纤维细胞具有与肌癌相关成纤维细胞(mCAFs)相似的特征。免疫荧光实验检测到肿瘤和非恶性膀胱间质组织中存在的iCAFs和mCAFs。GO富集分析表明，iCAFs与细胞外基质组织、细胞迁移调节和血管生成有关，而肌肉系统过程、局部粘连和细胞外基质相关通路在mCAFs中显著富集。GSEA同样发现iCAFs与细胞外基质降解相关，表明其可能在肿瘤转移中发挥作用。细胞因子-细胞因子受体相互作用途径在iCAFs中富集，而肌肉收缩和PGC1A通路在mCAFs中富集。接下来，本研究鉴定了细胞因子在膀胱癌肿瘤组织中的表达水平，发现iCAF是CXCL12的主要来源，在TCGA BLCA数据生存分析发现，高表达的CXCL12与患者预后不良显著相关。SCENIC分析，进一步研究两种CAF亚群的功能。发现TCF21和TWIST2基序在iCAF中高度激活，TCF21与冠心病有关，能够增强平滑肌细胞的“纤维肌细胞”表型。
膀胱癌的成纤维细胞可分为两个不同的亚群
5. iCAFs在BC中具有促增殖作用
GO富集分析表明iCAFs具有生长因子活性，是各种生长因子的主要来源。在这些生长因子中，iCAF特异性组因子IGF1与较差的总生存率有关，因此可以推断iCAF促进肿瘤细胞增殖，该结论也通过流式细胞实验进行了验证。
iCAFs促进癌细胞增殖
6. 单细胞转录组数据与公共数据关联分析
结合TCGA数据，发现只有iCAFs和mCAFs的积累与较差的总生存(OS)有关，一系列分析均表明CAFs与膀胱癌的肿瘤进展密切相关。进一步分析来自TCGA的数据，发现iCAF特异性标志物PDGFRA与膀胱癌患者较差的OS显著相关，而mCAF标志物RGS5则不相关，这表明iCAF可能比mCAF有更重要的作用。
肿瘤微环境异质性导致产生了膀胱癌的分子亚型
7. 构建基于iCAF调控的细胞-细胞互作网络
利用CellphoneDB2，本研究构建了细胞类型之间的细胞相互作用网络。考虑到GO分析和GSEA的结果以及本文数据中的表达丰度，本研究收集了包括生长因子、CCL和CXCL家族在内的相互作用对的数据。结果发现iCAFs分泌CXCL12与BC的免疫浸润状态有关，iCAFs产生VEGF，包括VEGFA和VEGFB，它们与内皮细胞上的VEGF受体结合，促进血管生成。FGFR1在iCAFs和ECs上表达，FGFR3在肿瘤细胞上表达，这些受体可以结合FGF（包括来自iCAFs的FGF2和FGF7）并具有增殖作用。IGF1的受体IGF1R在肿瘤细胞和间质细胞上表达，表明iCAF也可能影响顺铂的耐药。总之，本研究结果预测iCAFs可以促进肿瘤细胞和基质细胞的增殖，并有可能招募免疫细胞进入肿瘤阶段。
膀胱癌肿瘤微环境中的细胞-细胞通信网络构建
亮点总结
1. 通过标记基因对肿瘤组织中的细胞进行聚类分型，鉴定出8个细胞类群。
2.进一步对肿瘤相关的细胞进行亚型分类，筛选出与肿瘤发生发展最相关的一类细胞群体（炎性癌症相关成纤维细胞iCAF）
3.通过体外细胞实验、TCGA数据库数据挖掘、细胞-细胞相互作用网络构建研究手段，综合利用生信分析结合细胞实验，逐步挖掘验证关键细胞亚型对肿瘤影响的分子机制。
参考文献：
Chen Z, Zhou L, Liu L, et al. Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma. Nat Commun. 2020; 11(1): 5077.