七日谈06.免疫治疗前景无限好！（手术或放化疗 免疫治疗是大势所趋）
免疫治疗势必成为人类攻克肿瘤的利器。肿瘤的治疗之路，实际上一个漫长的过程。时至今日，肿瘤治疗的方案已经非常成熟，从外科手术、微创手术→放疗→化疗→靶向治疗及如今火热的免疫治疗，肿瘤治疗简史值得需要我们了解。
外科手术治疗，1882年，威廉·霍尔斯特德首次采用乳腺癌根治性乳房切除术。
放疗，1897年，埃米尔·赫尔曼·格鲁贝用X光片治疗了一名乳腺癌患者。
化疗，1941年，查尔斯·布伦顿·哈金斯指出激素与前列腺功能之间存在着明确的关系，提出雌性激素可用于治疗小鼠前列腺癌。（注：1966年，查尔斯·布伦顿·哈金斯和佩顿·劳斯因在前列腺癌激素治疗和肿瘤诱导病毒方面的发现分别获得诺贝尔生理学或医学奖。）
免疫治疗，2010年，一种阻断CTLA-4蛋白的单克隆抗体药物ipilimumab上市，可提高晚期黑色素瘤患者的生存率。2014年，免疫检查点抑制剂Pembrolizumab (Keytruda) 和nivolumab (Opdivo)，被批准用于治疗黑色素瘤。
免疫治疗中的全身反应
肿瘤免疫治疗从根本上增加了肿瘤的治疗手段，除了嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）、BiTE疗法和肿瘤疫苗外，美国食品和药物管理局（FDA）已批准7种免疫检查点抑制剂用于19种不同的肿瘤治疗。主流观点认为，免疫治疗通过重新激活肿瘤微环境（TME）中的细胞毒性效应器来发挥作用，但全身反应在有效免疫治疗中的作用也得到了越来越多的认可。最近研究表明，免疫检查点抑制剂，包括PD1/PDL1轴阻断剂，依赖系统性免疫反应来实现有效的抗肿瘤反应。此外，微生物组在免疫调节中的作用也逐渐被重视。
完整的外周免疫对免疫治疗效果至关重要
免疫检查点抑制剂发挥疗效需要完整的外周免疫功能、沟通和转运。全身化疗对外周免疫完整性的破坏会引起全身淋巴细胞耗竭和长期免疫记忆丧失，从而阻碍PD1抑制剂的治疗效果。相比之下，局部化疗可以保留外周免疫，其可与PD1抑制剂协同诱导树突状细胞的浸润肿瘤和抗原特异性效应T细胞的克隆性扩增。CD103 树突状细胞亚群能以CCR7依赖的方式由肿瘤部位迁移到引流淋巴结（dLN），从而将肿瘤抗原转运到外周免疫系统来激活肿瘤特异性CD8 和CD4 细胞（图2）。cDC2s同样能够实现上述肿瘤抗原转运以及肿瘤特异性CD8 和CD4 T细胞的激活；然而，该过程通常受到肿瘤内Treg细胞的抑制。最近证据表明，从肿瘤迁移到引流淋巴结的树突状细胞可以将抗原呈递到淋巴结驻留的树突状细胞，这些树突状细胞也可以激活肿瘤特异性T细胞（图2），激活的肿瘤特异性T细胞进而从淋巴结向肿瘤浸润，这种肿瘤-免疫循环是天然和治疗诱导的抗肿瘤免疫中的重要过程。阻断淋巴细胞从淋巴器官流出或手术切除肿瘤引流淋巴结会降低免疫治疗效果，这进一步证实抗肿瘤免疫的系统性。强大的适应性免疫反应赋予外周产生免疫记忆，抗肿瘤反应后，从次级淋巴器官（包括脾脏、淋巴结和血液）迁移来的T细胞足以在动物模型上起到保护作用。这项研究同样表明，当在部位进行局部治疗时，联合系统性地PDL1阻断可以破坏播散性肿瘤的耐受性。
显而易见的是，抑制PD1/PDL1轴产生的影响不仅仅是阻断肿瘤局部的免疫抑制信号。最新研究阐明，在免疫检查点治疗这种情况下，驱动反应的关键是外周的免疫细胞（而不是肿瘤微环境驻留的免疫细胞）。首先，仅在宿主PD1和PDL1完整表达的模型中观察到免疫检查点抑制治疗获益，并且对肿瘤细胞PDL1表达的依赖性较小。除了肿瘤细胞外，大多数表达PDL1的细胞是抗原呈递细胞，包括巨噬细胞和cDCs。在黑色素瘤或卵巢癌患者中，肿瘤内巨噬细胞和cDC上PDL1的表达水平与抗PDL1和抗CTLA4治疗的临床完全反应相关。此外，最近有几个研究小组证明，树突状细胞在PDL1阻断效果中发挥着重要调节作用。在MC38皮下小鼠肿瘤模型中，靶向性清除cDC（而非巨噬细胞）的PDL1表达可显著降低CD8 T细胞反应和PDL1阻断引起的肿瘤缩小。这种相互作用的关键部位似乎是肿瘤引流淋巴结，因为引流淋巴结中的肿瘤特异性PD1 T细胞与表达PDL1的cDCs存在高度共定位。尽管效果低于系统性PDL1阻断，选择性靶向引流淋巴结中表达的PDL1足以在两个同基因模型中诱导有效的抗肿瘤反应。引流淋巴结中PDL1 cDC和PD1 T细胞之间的相互作用进一步证实cDC上PDL1表达的意义，也预示黑色素瘤患者的肿瘤播散状态。在转移性黑色素瘤患者中观察到引流淋巴结中频繁的PD1和PDL1相互作用，这可以用于预测非转移性黑色素瘤患者的早期转移。引流淋巴结通过线粒体激活的方式增强效应和记忆T细胞的发育，可进一步提高荷瘤小鼠的PD1阻断效果，也再一次强调系统性免疫是肿瘤缩减的最佳治疗方式。
有效的免疫治疗驱动新生免疫反应
有效的抗肿瘤反应最终需要TME内的功能性效应淋巴细胞介导肿瘤细胞杀伤。然而，最近研究表明，随着时间的推移，肿瘤内T细胞会进入终末耗竭状态，使它们无法发挥效应T细胞功能（图2）。对小鼠和肿瘤患者CD8 T细胞的表观遗传学分析表明，肿瘤内T细胞经历广泛的染色质重塑，将细胞锁定在功能失调状态，降低其产生TNF和IFNγ的能力。（非常重要！）
在临床前模型中，抗肿瘤免疫过程是双阶段的。在肿瘤刚切除的早期，T细胞重塑是可逆的；但是第二波表观遗传重塑导致T细胞功能障碍不可恢复，其特征为CD101和CD38共表达。有研究已确定，转录因子TOX是慢性T细胞刺激下转录和表观遗传重编程的关键调节因子，可诱导T细胞耗竭。肿瘤内T细胞耗竭由肿瘤微环境中的应激源、慢性TCR刺激和免疫检查点蛋白通路驱动。最新一项研究表明，肿瘤内的代谢改变会导致T细胞中积聚具有高水平活性氧和整体受损膜电位的结构受损线粒体。受损的线粒体足以诱导表观遗传重塑，进而导致T细胞耗竭，但未在脾脏或引流淋巴结的外周T细胞中观察到此类现象。黑色素瘤患者对免疫检查点抑制剂的临床反应与存在的干细胞样CD8 T细胞状态相关，与耗竭CD8 T细胞相比，其共抑制分子表达减少，记忆功能提高，细胞相关的转录和表观遗传学进程激活。干细胞样CD8 T细胞可通过转录因子TCF1（参与干细胞相关WNT信号通路）高表达，CD39和TIM3低表达来鉴别（参考文献107）。因此，免疫治疗的疗效依赖于TME内效应CD8 T细胞的质量，但毒性微环境的持续存在会迅速导致T细胞耗竭，从而失去有效清除肿瘤的能力。
免疫治疗引起新的外周免疫反应，造成新的效应T细胞浸润，从而避免局部免疫功能失调（图2）。已有研究表明，PD1和PDL1阻断将诱导免疫治疗前不会出现的新生T细胞克隆进入TME。最近一项关于基底细胞癌的研究表明，68%的CD8 T细胞克隆为PD1阻断后出现的新克隆，其中84%表达抗原活化的耗竭标志物，这些细胞代表新的TCR特异性组群，提示激活新的抗原靶点。并且35.5%的新克隆是在血液中被检测到的；在免疫治疗前，这一数值仅有11.8%。转移性黑色素瘤、肾癌、肺癌和结肠癌患者血液中T细胞克隆与肿瘤之间也存在相关性。抗CTLA4能显著增加黑色素瘤患者的外周T细胞反应，提示新的T细胞启动是一种机制。
CD8 T细胞内CD28对PD1阻断至关重要，为幼稚T细胞启动提供了必要的共同刺激。NSCLC患者的血液中，CD28-CD57 KLRG1 的衰老T细胞占有较高的基线比例，且其与免疫检查点抑制剂的耐药相关。在经典霍奇金淋巴瘤患者中，基线时的外周T细胞克隆多样性与PD1阻断效果相关，说明系统的免疫环境与免疫治疗的相关性。这一标记在具有完全应答的患者中被单一克隆补充，可能包括未经抗原处理的幼稚T细胞。在这种肿瘤环境下，抗肿瘤免疫反应更依赖于CD4 T细胞，伴随着CD4 T细胞TCR多样性增加，循环B细胞丰度增加，新的效应器抗体依赖性细胞毒性增强。综上所述，不仅外周免疫参加抗肿瘤免疫应答，并且具有新抗原特异性的新的T细胞对免疫治疗有着重要作用（图2）（果友江洋）。
倾向于驱动新一次免疫反应的策略在临床试验中获得越来越多关注，包括利用各种策略，如激动剂CD40抗体促进树突状细胞的活性。数项研究表明，免疫检查点的阻断依赖于解除cDCs的限制，以使得效应T细胞启动，但当抗原呈递细胞预先存在的激活不足或不存在时，这种策略就会失败。胰腺癌患者对免疫检查点抑制剂具有抵抗；但临床前模型表明，联合CD40的激动剂可以产生独立于TLR、STRING或IFNAR信号的胰腺癌完全消退，并延长生存期。这种KrasLSL-G12D/ 、Trp53LSL-R172H/ 、Pdx1–Cre特定模型的功效依赖于宿主BATF3 cDC1s和CD40，以及效应性CD4 和CD8 T细胞，这些细胞在血液和引流淋巴结中大量扩增，表明外周免疫的活化作用。一项针对转移性胰腺癌患者的早期临床试验为此带来希望，其中CD40激动剂结合PD1阻断剂、吉西他滨和白蛋白紫杉醇化疗的结果显示出50%以上的客观反应率，以及CD4 和CD8 T细胞在血液中的诱导增殖。CD40激动剂只是一种策略，表明将免疫学中的“冷”肿瘤环境转化为“热”肿瘤环境需要新一次免疫反应而不是重新激活免疫系统。
肿瘤中的二次免疫挑战
免疫系统先前经历的刺激和状态极大程度上塑造未来面对新挑战的反应。我们知道，改变基线的细胞因子水平、细胞成分和活化状态会影响慢性感染和合并感染模型中继发反应的性质和程度。由于肿瘤患者个体的全身免疫状态明显被重新组织，因此，这可能对新免疫反应的协调产生功能性的影响。由于常规肿瘤治疗的影响，识别肿瘤患者体内应对免疫攻击的全身性功能缺陷，如疫苗或感染，仍然具有挑战性。接种流感疫苗后，肿瘤患者能够产生与健康个体相当的、可被检测到的抗体。然而，正在发生的2020 SARS-CoV-2流行中，感染SARS-CoV-2的肿瘤患者更有可能出现严重症状并表现出更高的死亡率。值得注意的是，即使是未接受肿瘤治疗的感染患者，其死亡和重症的风险也会增加。这一观察结果表明，全身免疫系统的多种细胞类型表型和组成的实质性改变可能导致对TME外的二次攻击发生免疫反应改变。正如上一节所述，由于功能完好的外周免疫系统对于新的抗肿瘤免疫反应的发展至关重要，因此必须了解在肿瘤负荷状态的背景下，如何做出免疫反应。
最近研究已经开始通过研究那些不与原始肿瘤共享抗原的免疫攻击的效果，从机制上分析为什么肿瘤负荷免疫状态会导致外周二次免疫反应减弱。通过利用临床前小鼠模型系统，避免在患者体内影响研究的许多混杂因素。据报道，携带乳腺癌的小鼠在受到免疫攻击时产生较弱的抗体反应和T细胞增殖，并且对同种异体肿瘤的排斥反应减弱（图3a）。同样，我们的研究小组表明，AT3乳腺癌小鼠感染单核细胞增多性的李斯特菌后，脾脏抗菌反应减弱，其特征是感染后2天树突状细胞上CD86、CD80和CD83的表达下降（图3b）。最终导致感染7天后，与感染单核细胞增多性李斯特菌的健康对照小鼠相比，CD8 T细胞的增殖和分化减少，这可以通过CD40激动剂治疗或手术切除肿瘤来挽救（图3b）。值得注意的是，手术切除肿瘤也恢复体液免疫和细胞免疫反应。与之类似，对单核细胞增多性李斯特菌的感染，携带Pan02胰腺肿瘤的小鼠脾脏中CD8 T细胞反应也表现出T细胞分化紊乱，其特征为获得耗竭命运。与感染的健康对照小鼠相比，患有B16黑色素瘤或AT3乳腺肿瘤28的小鼠中，脾脏CD8 T细胞的增殖受到抑制，以响应淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染。与接种的健康对照小鼠相比，接种卵清蛋白（OVA）和CpG的胰腺肿瘤小鼠脾脏中OVA特异性CD8 T细胞增殖和分化也会受损。这种损伤与树突状细胞功能障碍有关，可以通过联合FLT3L和CD40激动剂治疗，提高树突状细胞的数量和活性来挽救（图3b）。在PyMT-B6乳腺癌小鼠模型中，使用含有Poly I:C（TLR3激动剂）和OVA的基质胶塞作为和原发肿瘤不共享抗原的二次免疫原攻击。与健康对照小鼠相比，先前存在的恶性肿瘤驱动基质胶塞和引流淋巴结内cDC1s的数量显著降低，进而导致在基质胶塞中浸润的特定OVA-CD8 T细胞的数量减少。综上所述，这些研究结果表明，免疫反应的先天和适应性武器，特别是树突状细胞和CD8 T细胞的相互作用，在肿瘤的背景下并不能以最佳状态发挥作用（图3）。因此，旨在刺激新的CD8 T细胞反应的治疗策略必须克服这些免疫挑战。
肿瘤的全身免疫生物标志物
尽管人们对利用全身免疫系统的预测性生物标记物的开发非常感兴趣，但绝大多数的免疫治疗临床试验仍然没有使用生物标记物来引导纳入。目前，TME中一些免疫学特征已被证明与各种情况下的预后相关，但还没有建立足够的全身免疫生物标记物来指导床边决策。因此，来自外周血的免疫生物标志物有机会帮助指导患者的治疗决策。
循环蛋白生物标志物。血清或血浆中循环蛋白的定量通常在不同病理情况下进行，因此一些研究已经检验这种方法在开发用于肿瘤治疗的预测性生物标志物方面的潜力（Table 2）。一般而言，与持续免疫反应相关的可溶性因子含量较高似乎表明预后有所改善。小细胞肺癌患者在治疗过程中血中IL-2水平升高、IL-6和TNF水平降低以及IL-4水平升高都与改善对免疫检查点抑制剂的反应有关。此外，一项对非小细胞肺癌患者的研究发现，血清中多种炎性细胞因子含量的升高与对抗PD1抗体治疗的反应改善和总存活率有关。相比之下，最近研究发现，血清中的中性粒细胞趋化因子 IL-8的高水平与黑色素瘤患者对免疫检查点抑制剂的不良反应有关。除了分泌因素，研究还探究循环中的淋巴细胞抗原受体谱系是否提供预后信息。在转移性黑色素瘤和经典型霍奇金淋巴瘤中，TCR谱系的基线多样性也可以预测对抗PD1和抗CTLA4 免疫检查点抑制剂的反应。