如果对外泌体纯度要求比较高怎么办？
前些天给大家推荐的【史上最全细胞外囊泡研究方法综述】中提到超离和蔗糖梯度超速离心是目前分离外泌体的gold standard。超速离心是我们都知道的非常well-established protocol，也是CNS级别大paper都使用的分离外泌体的方法；蔗糖密度梯度超速离心（其实还有后来发展的碘克沙醇密度梯度离心）是在普通超速离心基础上建立的分离超高纯度外泌体的方法。
虽然根据外泌体之家游虾的报道，外泌体大牛Thery在前几天的AACR年会上的超离+密度梯度离心得到的pellet是否可以称为exosomes表示了质疑，但是，目前并没有公认的比超离/密度梯度离心更严谨的外泌体提取/纯化方法。
所以，
如果你对外泌体的纯度要求高，可能依旧只能乖乖超离。
如果你对外泌体的纯度要求特别高，那就用密度梯度离心吧。
作为耀眼大paper分离外泌体的标准要求，为什么要用超离这里就不再赘述了。这里再给大家分析2件事情，当你要拿外泌体做蛋白或RNA成分分析时，你该用什么方法提取外泌体？
一、外泌体蛋白成分分析
做外泌体蛋白质谱分析，沉淀法容易产生杂蛋白污染，这一点是很多外泌体研究小伙伴们亲身经历过的。那么超离可以吧？超离一次也是不行的，要用PBS重悬再超离清洗一次，更有甚者PBS清洗2次。最好是能用密度梯度离心进行纯化。否则一堆的杂蛋白去做质谱，得出的结果完全没法做后续分析，而且投文章review那关也是过不掉的。
二、外泌体RNA成分分析
目前大多数研究者都在研究外泌体的RNA成分。做外泌体RNA成分分析（RNA-seq、芯片等）时，我们很多人都认为，做RNA分析嘛，蛋白污染不怕，又不是分析蛋白。其实不然。我们来看一张图，
沉淀法或者仅普通超离一次得到的所谓的外泌体Pellet，其实包含着大量上图中所列的各类脂蛋白、乳糜、蛋白聚合物等。而这些蛋白成分是会携带RNAs的！
举个栗子，我们再来看2011年的一篇NCB文章，该研究主要介绍了miRNAs在血浆中通过高密度脂蛋白（HDL）递送至受体细胞。作者使用的什么方法提取的外泌体呢？是比沉淀法要严谨的超速离心！作者发现，miRNAs可以在in vitro和in vivo与HDL整合在一起，并通过HDL传递至靶细胞。然而，我们分离的外泌体中是混有HDL的，所以在分析外泌体RNA成分的时候，不用担心杂蛋白的污染或许是一个误导。
ApoA-I是HDL的marker；Exo是超离得到的外泌体；Exo-Exo是超离得到的外泌体经去除HDL步骤后得到的更加纯的外泌体；Exo-HDL是超离得到的外泌体中混杂的HDL；HDL指纯的HDL
那该怎么办呢？用密度梯度离心吧。毋庸置疑，密度梯度离心是目前分离外泌体最纯的方法。但是…细心的读者会发现，这个HDL的密度与外泌体的密度十分类似！囧。。。这或许就是开头咱们提到的大牛Thery对自己在2006年建立的方法（Curr Protoc Cell Biol, 2006）产生怀疑的原因之一吧。
说到这里，可能有些读者要抓狂了，连当前堪称gold standard能做的high purity的基于超速离心的密度梯度离心都不能做到完美，那该如何是好？囧。小编抛出这些问题主要是引发大家慎重思考，请各位不要恐慌，囧。如果采用了目前领域所能做到的最佳的方法了，那么投文章时review还能说什么呢。
上述几个例子是比较极端的情况，大多时候使用超速离心进行外泌体分离还是会得到reviewer的认可的。Anyway，这算是外泌体提取方法学的前沿了，襁褓中外泌体研究总归是要发展的。对于我们普通研究者而言，你只要知道，在外泌体纯度方面，密度梯度离心>普通超速离心>沉淀法。如果要投好杂志，普通超速离心已是标配，能用密度梯度离心最好了。而且，据小编小道消息，美帝很多实验室都开始把蔗糖垫超速离心作为标配了。
总之，根据自己期望发表的论文水平选择合适的外泌体提取方法。领域的要求越来越高，各位小伙伴的外泌体课题得抓紧了。
参考文献：
Shao, H., et al. (2018). "New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles." Chem Rev.
Simonsen, J. B. (2017). "What Are We Looking At? Extracellular Vesicles, Lipoproteins, or Both?" Circ Res 121(8): 920-922.
Vickers, K. C., et al. (2011). "MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins." Nat Cell Biol 13(4): 423-433.
Thery, C., et al. (2006). "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol Chapter 3: Unit 3 22.
编辑：土豆
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