GV-971:肠道菌群——阿尔兹海默症的新靶点？
一、文献背景：
阿尔茨海默症（AD），是一种慢性神经退行性疾病，通常随着时间的推移开始缓慢并逐渐恶化，这是60-70％痴呆病例的原因。阿尔茨海默病于中晚期，特征还是比较明显，诊断也不困难。比较典型的症状就和《都挺好》里的苏大强一样，记不清最近的事情（但以前的可以记得），认不得人，脾气变得古怪暴躁，说话不利索，生活渐渐不能自理，甚至连洗澡、穿衣都困难。别说医生不会误诊，就连普通人也常常知道：哦，这是老年痴呆了。
随着疾病的进展，症状可能包括语言问题，情绪波动，失去动力，不管理自我护理和行为问题。越来越多的证据表明，淀粉样蛋白假说认为细胞外淀粉样蛋白β（Aβ）沉积是该疾病的根本原因。该病目前尚无有效药物。
据《WordAlzheimer Report 2018》统计，2018年全球有近5000万AD患者，到2050年预计将增加至1.52亿人，这对全球来说是极重的医疗负担。目前，美国FDA批准的六种AD治疗药物（卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐、美金刚、美金刚联合多奈哌齐和他克林）均为症状改善药物。这些药物既不能减轻AD的病理变化，也不能延缓疾病的病程进展。近十年来关于AD药物的研发可以说是几乎没有任何突破性进展。
阿尔兹海默症，我们常常称它AD，是一种慢性神经退行性疾病，通常随着时间的推移开始逐渐恶化。阿尔兹海默症是一种几乎人人都非常熟悉的疾病，我们都知道，它常常发生在60岁以上的老年群体中。这类疾病的特征比较明显，比较典型的症状就比如：记不清最近做过的事情，认不得身边的朋友和家人，说话不利索，生活渐渐不能自理，甚至连洗澡、穿衣等日常活动，那些在我们正常人看起来十分简单的行为，对于AD患者都十分困难。在这种情况下，别说医生不会误诊，就连普通人也常常知道：“哦，这是老年痴呆了。”AD疾病就如同脑海中的一块橡皮擦，将患者脑中的记忆一点一点擦干净。据《WorldAlzheimer Report 2018》统计，2018年全球有近5000千万的AD患者，到2050年预计将增加到1.52亿人。而且，全球大约58%的AD患者都生活在中低收入的发展中国家。虽然AD并不是致死率最高的疾病，但它给全球带来了极大的医疗负担，据估计，在未来几年这项疾病造成的全球经济损失至少上万亿美元。
二、研究成果：
最近，越来越多的证据表明肠道微生物的失调与阿尔茨海默病（AD）进展之间存在关联，但肠道微生物群在AD发病机制中的作用仍然模糊不清。
2019年9月6日，中国科学院上海药物所耿美玉团队在Cell Research 在线发表题为“Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota andsuppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibitAlzheimer’s disease progression”的研究论文，该研究使用AD小鼠模型，发现在AD进展期间，肠道微生物群组成的改变导致苯丙氨酸和异亮氨酸的外周积累，其刺激促炎性T辅助细胞1（Th1）细胞的分化和增殖。
脑浸润的外周Th1免疫细胞与M1小胶质细胞激活有关，导致AD相关的神经炎症。重要的是，在由AD引起的轻度认知障碍（MCI）的两个小的独立队列中也观察到苯丙氨酸和异亮氨酸浓度的升高以及血液中Th1细胞频率的增加。此外，GV-971，一种在中国的3期临床试验中表现出稳定和一致的认知改善的低聚甘油钠，抑制肠道失调和相关的苯丙氨酸/异亮氨酸积累，利用神经炎症并逆转认知障碍。总之，该研究结果突出了肠道微生物群失调促进神经炎症在AD进展中的作用，并提出了通过重塑肠道微生物群进行AD治疗的新策略。
三、研究思路：
1.AD的进展与肠道菌群的改变和免疫细胞浸润之间的联系
为了评估肠道微菌群的变化在AD发病机制中的作用，研究者使用了5XFAD转基因(Tg)小鼠模型，该模型目前广泛用于AD研究中，用来研究AD相关的病理特征，包括严重加速的认知障碍、出生后2个月的淀粉样蛋白沉积、出生后4个月的突触变性以及6个月的行为学改变等。实验小鼠大脑海马体中突触素的表达水平从第7个月显著下降到第9个月，表明突触退化(图1A)，而Tg小鼠的行为测试显示9个月大时辨别学习能力明显下降(图1B)。然后，研究者使用16S核糖体RNA(rRNA)基因扩增子测序比较了AD进展中不同阶段的Tg小鼠和WT小鼠的肠型变化。结果发现，肠道菌群中有显著的聚类效应，Tg小鼠聚类为Muribaculaceae家族下的Norank属，WT小鼠聚类为Lactobacillus属(图1C)。
研究者发现，在Tg小鼠的AD进展过程中，肠道菌群组成发生了显着的变化，而在WT小鼠中几乎没有观察到任何变化(图1D)。利用OTUs跟踪Tg小鼠体内不同菌门丰度的动态变化，发现在疾病进展过程中Tg小鼠肠道微生物有两种明显的变化。在2个月龄时，Bacteroides, Firmicutes和Verrucommicrobia是门水平上最丰富的三种细菌(分别为47.3%、33.0%和12.2%)。在7个月龄时，Firmicutes成为优势门(62.8%)，而Bacteroides和Verrucommicrobia的丰度明显下降，表明菌群的类型发生了变化(图1E)。这些结果表明，与WT小鼠的肠道微生物形成了强烈的对比的是，Tg小鼠的肠道菌群是高度动态变化的。同时，在另一种广泛用于AD研究的模型APP/PS1双转基因小鼠模型也得到了类似的结果。小胶质细胞激活的标志IBA1在AD小鼠脑组织切片中的免疫染色显示了小胶质细胞激活的两个明显阶段，分别在第3个月和7-9个月(图1F)。在2-3个月大的早期阶段，M1和M2小胶质细胞比例都持续增加，而在接下来的几个月中，M1亚型比例继续增加，并在7-9个月达到高峰，而M2型小胶质细胞从3个月到5个月下降，此后保持较低水平(图1G)。观察到Tg小鼠大脑中CD45+细胞的频率明显高于WT小鼠，与IBA1染色结果相似(图1F，H)。
研究者进一步分析了在AD进展过程中的一系列时间点中CD45+细胞亚型的变化(图1I)。浸润性Th1和Th2细胞是CD4+细胞的两种主要亚型，研究者发现在实验观察期间其表现出与M1和M2小胶质细胞相似的动力学变化(图1K)。此外，研究者还分析了在AD进展的早期和晚期肠道微生物丰度和大脑免疫细胞比例之间的相关性。研究者注意到，细菌的丰度变化在早期(2-3个月)与Th2和M2细胞的变化一致(图1L，顶部)，在晚期(7-9个月)则与Th1和M1细胞的变化相关(图1L，底部)。
2.肠道菌群是大脑免疫细胞浸润和小胶质细胞激活所必需
为了确定肠道菌群变化是否能驱动外周免疫细胞浸润以及AD进展中的神经性炎症，研究者使用了含有氨苄西林(0.1 mg/mL)、链霉素(0.5 mg/mL)和粘菌素(0.1 mg/mL)处理，消除肠道菌群的影响。在Tg小鼠中进行抗生素处理导致肠道微生物丰度显着减少(图2A)。随着这种变化，研究者观察到大脑内浸润的促炎Th1细胞(图2B)和M1细胞(图2C)也逐渐减少。此外，这些发现得到了同笼饲养实验的证实，其中WT小鼠与同龄的Tg小鼠从出生起共住了7个月，共同居住的WT小鼠表现出与Tg小鼠相当的辨别学习能力下降，表明长期暴露于Tg细菌可能导致认知障碍。
对这些小鼠肠道菌群变化的分析表明，共同居住的WT小鼠和Tg小鼠之间肠道微生物区系的组成非常相似，但与单独居住的同龄WT小鼠的肠道微生物区系组成明显不同(图2D)。此外，共同居住的WT和Tg小鼠之间的Th1细胞浸润也具有可比性，两者都显著高于单独居住的WT小鼠(图2E)。同时，M1细胞在共同居住的WT小鼠中仅略有增加(图2F)，表明微生物区系的变化主要影响浸润的免疫细胞而不是常驻的免疫细胞，这些结果表明肠道微生物变化在AD进展过程中可以驱动外周免疫细胞浸润和神经炎性激活。
3.GV-971通过塑造肠道菌群从而减轻神经炎症
从7月龄开始口服GV-971一个月之后的Tg小鼠，可以发现其肠道菌群的组成有了显著地双向变化(图4A)。与肠道菌群结构变化相一致，GV-971在Tg小鼠中的治疗，打破了先前观察到的脑淋巴细胞和肠道细菌变化之间的相关性(图4C)，即减少大脑Th1细胞的比例(图4D)，显著减少小胶质细胞激活(图4E)，并降低多种脑细胞因子水平(图4F)。同时，GV-971的处理也显著减少了Aβ蛋白斑块的沉积以及tau磷酸化，并改善了Tg小鼠辨别学习能力的下降(图4G-I)。
研究者进一步进行菌群移植实验，将GV-971处理的Tg小鼠的粪便移植到受体C57BL/6 WT小鼠。研究发现，与未经GV-971处理的Tg小鼠相比，GV-971处理的Tg小鼠的粪便导致受体小鼠脑组织中的Th1细胞减少(图3)。与此同时，抗生素处理削弱了GV-971对APP/PS1小鼠模型中肠道菌群结构，Th1细胞，IBA1水平和细胞因子表达的影响。此外，用GV-971的一种异构体寡聚古罗糖醛酸 (oligo-guluronicacid, PG)或用聚甘露酸硫酸盐、聚古鲁酸硫酸盐、肝素、硫酸肝素处理均未显示治疗效果，表明GV-971的糖骨架可能解释了其对肠道菌群的特定影响。以上结果提示，GV-971可通过调节肠道菌群失调来减轻神经性炎症和认知功能下降。
4.GV-971通过调节氨基酸代谢抑制神经炎症
近年来，相关研究突出了肠道微生物相关代谢物在影响宿主免疫系统中的作用。为了验证上述代谢物可能参与免疫调节，研究者将7月龄Tg 小鼠体外培养的粪便上清添加到naïveCD4+ T细胞培养中，刺激naïve CD4+ T细胞分化为Th1和Th2细胞。相反，GV-971处理的Tg小鼠粪便上清液可以抑制Th1分化，促进Th2分化。接下来，研究者采用非靶向代谢组学技术来表征粪便代谢组。从WT，Tg和GV-971处理的Tg小鼠的粪便样本中鉴定出总共11289种代谢物。在与数据库匹配的那些代谢物中，与WT小鼠相比，Tg小鼠中有124种代谢物的丰度发生了显著变化。这些改变的代谢物被进一步用Human Metabolome Database和KyotoEncyclopaedia of Genes and Genomes数据库进行比对注释，产生总共31种代谢物，这些代谢物在WT，Tg和GV-971处理的Tg小鼠之间有差异变化，使用MBROLE或MetaboAnalyst对上述代谢物的途径富集分析，进一步揭示了氨基酸相关代谢途径和酶的显著变化，特别是苯丙氨酸相关途径(图5A)。
使用随机森林算法对这些氨基酸进行分类，苯丙氨酸排序为在WT和Tg之间不同的首位，其次是异亮氨酸、5-羟色胺、组氨酸和乙酰鸟氨酸(图5B)，上述结果提示它们与疾病进展密切相关。接下来，研究者检测了GV-971处理或未处理的Tg小鼠粪便和血液样本中所选氨基酸的浓度，并将其与WT小鼠进行了比较。结果发现，Tg小鼠粪便中苯丙氨酸和异亮氨酸的浓度明显高于WT小鼠，而GV-971处理显著降低了它们的浓度，使其浓度与WT小鼠相当(图5C)，同时在血液中检测到苯丙氨酸和异亮氨酸浓度的类似变化(图5D)。为了验证这些氨基酸的升高是否是肠道菌群结构的变化引起的，研究者在FMT研究中同样检测了上述氨基酸的浓度。发现，2月龄WT小鼠的粪便可以显著降低Tg小鼠体内苯丙氨酸和异亮氨酸的浓度。同样，在不同月龄的共同饲养的WT小鼠中，血液中苯丙氨酸和异亮氨酸浓度也升高，与Tg小鼠相当。
与此同时，为了评估苯丙氨酸和异亮氨酸对T细胞分化的直接影响，研究者将naïve CD4+ T细胞暴露于苯丙氨酸或异亮氨酸或GV-971共同处理4天，并用流式细胞术检测TH1细胞比例变化。实验结果发现，暴露于苯丙氨酸或异亮氨酸的Th1细胞分化明显增强，而这种作用可以被GV-971处理抑制(图5E)。此外，苯丙氨酸和异亮氨酸显著促进Th1细胞的增殖，GV-971处理可以显著地抑制苯丙氨酸诱导的Th1细胞增殖，但几乎不改变异亮氨酸的作用(图5F)。此外，研究者用腹腔注射苯丙氨酸和异亮氨酸来治疗WT小鼠，发现血液中Th1细胞比例显著增加(图5G)。最后，研究者还探讨了上述发现是否可以在MCI病人中得到验证。事实上，研究者发现，在AD受试者血液中苯丙氨酸和异亮氨酸浓度以及Th1细胞比例明显高于年龄匹配的健康对照(图5H，I)。此外，由于在AD队列中，血液中苯丙氨酸和异亮氨酸水平的增加也在另一个小MCI队列中得到证实(图5J)，这些结果表明血液中苯丙氨酸和异亮氨酸的异常积累和Th1比例的升高可能是区分AD患者和健康受试者的轻度认知障碍的标志。
四、结论和展望：
目前针对AD进展中肠道和大脑之间的联系机制的研究非常有限，随着人们对肠道菌群代谢物的研究不断深入，了解在AD进展中与肠道菌群和脑神经炎症相关的特定代谢物是十分必要的。基于此，研究者更加关注在探讨肠道微生物群与AD进展之间的机制联系，并探讨潜在的干预策略。为此，研究者阐明了AD发展不同阶段肠道菌群动态变化与神经炎症的关系，首次揭示了AD肠道菌群失调诱导大脑神经炎症的具体分子机制。
更为重要的是，本文还同时验证了该团队研发的治疗AD原创新药GV-971，一种酸性线性寡糖的混合物，其分子量从二聚体到十聚体不等(分子量可达~1 kDa)，对AD转基因小鼠认知功能障碍的改善作用。首次从机制层面具体阐述了GV-971对AD产生疗效的原因，其通过重塑肠道菌群平衡状态，降低肠道菌群代谢产物特别是苯丙氨酸和异亮氨酸的产生，减少外周及中枢炎症，减少脑内Aβ蛋白的沉积和tau过度磷酸化，从而显著改善认知功能障碍。上述研究为阐明AD的发病机制提供了全新的研究思路，也为抗AD药物的研发提供了重要参考。
GV-971新颖的作用模式与独特的多靶作用特征，为阿尔茨海默症药物研发开辟了新路径，并有望引领糖类药物研发新的浪潮，对提升我国创新药物研究领域的国际地位具有深远意义。据悉，上海绿谷制药将按照流程，于年内向国家药品监督管理局提交GV-971用于治疗轻、中度阿尔茨海默症的上市申请许可。有关专家认为，GV-971是首先诞生在中国的原创产物，必将极大提升药物自主创新的“中国自信”。
中国本土研制的抗阿尔茨海默病(AD)原创新药甘露特钠胶囊(GV-971)的上市注册申请日前获得了国家药品监督管理局的有条件批准。绿谷制药董事长吕松涛介绍，GV-971即将于11月7日投产，并于12月29日前将把药物铺到全国的渠道，让中国患者受益。从明年起，将进行上市后研究。
（图为中科院上海药物所耿美玉团队与绿谷制药研究院的科研人员合影）
作者：王文静
编辑：柚子妈妈