多重PCR引物设计(2)——平衡反应体系
多重PCR的一个关键点在于反应体系的平衡。即使多重PCR体系内每对引物的特异性都很好，在单重PCR测试中扩增效果也非常好，但到了多重体系中却经常出现某些目标产物扩增不出来的现象。原因就在于反应体系的不平衡，这种不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂（SantaLucia, 2007）。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制住了，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加举步维艰了，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。正所谓'强者更强、弱者更弱'。而导致反应体系不平衡的因素很多，限于个人知识水平以及目前多重PCR引物设计理论发展的程度，这里列举我所知道一些因素：
- 非特异引物 如果引物与背景DNA有较多且结合能力比较强的结合位点，那么目的基因结合引物的机会就会受到竞争，从而影响扩增效率。
- 引物二聚体
包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的二聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竞争，影响扩增效率。
- 不一致的最佳退火温度
多重PCR反应中不同的模板及其引物使用同一个反应体系，退火温度等都是一致的，因此在引物设计的时候就需要尽量保证各引物的最佳退火温度一致，而目前大多数的引物设计软件都仅提供了Tm（解链温度）值，即使提供Ta（最佳退货温度）值，也是通过Tm值换算过来的。所以，在引物设计中，必须尽可能的使各引物之间的Tm值相近。这是目前的常用方法，但也有专家认为，引物的扩增效率和Tm值是否一致没有关系。
- 起始模板浓度不同
这一点显而易见，表达丰度不同的基因，其扩增容易程度相差很大。
- 引物的扩增效率
这个因素很重要，但也很笼统，它也许包含了上面提到的几个因素，但更多的因素其实我们还不清楚。引物的扩增效率到目前为止，还没有一个可以明确的定量计算方法。不过最近的一篇文章做了不错的尝试，利用QPCR的数据得到一个模型，可以用来预测引物与其目标序列的扩增效率。
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