慢病毒包装实验技术方法

慢病毒一般为HIV等为基础改造的接近无毒，感染后不进行复制的稳转株构建运载体。可以将目的基因携带并整合到细胞的基因组中，持续表达（普通转染一般只表达数天，随着分裂质粒会渐渐被稀释掉），进行长期试验。

慢病毒包装的过程和转染相似，主要区别在于慢病毒包装一般为多质粒混合转染（不同质粒含有病毒的不同元件），多个质粒的总质量和PEI的质量以及转染过程都与普通转染无异。

不同的是一般在转染后48h后，也就是换液后的30小时，收集细胞上清作为病毒的粗制品，来感染目的细胞。

以研发为目的的小规模生产是采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统（Cell Factories, Cell Stacks）或HYPERFlask的贴壁细胞。

采用传统的磷酸钙转染或者最近发展起来的PEI转染来转染最佳密度的细胞(<50%),后者的优点是不依赖培养条件、转然后不需要换液及可用于悬浮细胞转染。

原则上，小规模生产也可以采用阳离子转染试剂如lipofectamine、fugene及293fectin,它们转染也都获得了高水平表达。

通过比较不同的细胞培养系统，Aububel等并没有发现所评估的培养系统(培养瓶，一层或十层细胞工厂)所产生的慢病毒滴度有任何差异。

利用HYPERFask，Kutner等发现采用HYPERFask培养可以比用传统培养装置培养所产生的慢病毒每个表面单位高10倍，原因可能是前者有更高的氧气利用率。此外，HYSPERFask生产的慢病毒比传统培养皿生产的慢病毒所含细胞蛋白、核酸污染更低。

HEK293T细胞贴壁不牢，所以采用转瓶培养生产慢病毒时更困难，同时为了要保证细胞贴壁，转染条件的优化要更加小心。在这种背景下，Patel等证实在HEK293中过表达alpha-v和beta-3整合素可以提高细胞贴壁能力，进而提高转瓶中慢病毒的产率。然而，这种方法需要采用过表达整合素的重组HEK293。

293系列的细胞都是非常好转染的。有以下几个注意点：

1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态

2.转染的时间

3.转染试剂与质粒的比值

293T细胞生长速度更快，形态较293A细胞小，贴壁性比293细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养293、293T细胞培养及转染一点经验过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。

HEK-293细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。状态较好的293细胞细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3天即可长满。细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。

参考文献：

Otto-Wilhelm Merten, Matthias Hebben and Chiara Bovolenta.Production of lentiviral vectorsMolecular Therapy — Methods & Clinical Development (2016) 3, 16017;