NK细胞基因工程改善其功能

增强扩增和持久性

增强NK细胞体内持久性的策略包括对细胞进行基因工程以自主分泌细胞因子，例如IL-2或IL-15。

与用外源性IL-2刺激的 NK 92 细胞相比，用IL-2对NK-92细胞进行逆转录病毒转导增强了它们体外和体内的活性和抗肿瘤能力。

类似地，用膜结合 (mb)IL 15对NK细胞进行逆转录病毒转导可改善NK细胞增殖和持久性。我们小组已经 成功地用逆转录病毒载体改造CB衍生的 NK 细胞以分泌IL-15以增强其体内增殖和持久性，并表达CD19导向的CAR以提高其体内抗肿瘤活性。

另一个有趣的方法是 表达CAR的记忆样NK细胞的基因工程，最近显示可在淋巴瘤小鼠模型中产生有效的体内活性。

瞄准检查点

基于免疫检查点的疗法以免疫活性细胞的调节通路为目标，在一些癌症患者中取得了重大的临床进展、长期缓解和可能的治愈。大部分进展是通过T细胞实现的，但有令人信服的证据支持靶向NK细胞中的检查点可能同样有效。

NKG2A是一种抑制性受体，可识别非经典MHC-I、HLA-E。Monalizumab是一种抗NKG2A单克隆抗体，在26名难治性头颈部鳞状细胞癌患者的 II 期试验中与西妥昔单抗联合进行了研究。结果很有希望，8名患者实现了部分缓解（31 %)，14 名患者 (54%) 病情稳定，只有 4 名患者 (15%) 出现疾病进展。

使用shRNA (shRNA) 或siRNA沉默NK细胞中的NKG2A显示抑制抑制信号传导，随后在体外和体内增强NK细胞对表达HLA-E的癌细胞的细胞毒性。

最近，Kamiya等人设计了一种使用逆转录病毒载体生成缺乏 NKG2A的NK细胞的方法，该载体编码源自与内质网保留域连接的抗 NKG2A抗体的单链可变片段 (scFv)。过继输注的NKG2Anull NK细胞对表达HLA-E的肿瘤表现出增强的细胞毒性。

TIGIT（T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域）是另一种 NK 细胞检查点受体，可与肿瘤细胞表面的CD155 [也称为脊髓灰质炎病毒受体 (PVR)] 结合。TIGIT 通过基因敲除或单克隆抗体的使用已被证明可以释放 NK 细胞的抗肿瘤活性，从而在各种临床前小鼠模型中更好地控制肿瘤。

细胞因子信号传导 (SOCS) 蛋白家族的抑制因子其成员之一，在 NK 细胞生物学中起着重要作用通过减弱细胞因子信号传导和效应子功能来对抗癌症。由 CISH 基因编码的细胞因子诱导型含SH2蛋白 (CIS)，是NK细胞中的重要检查点分子，并在iPSC衍生的NK中响应IL-15。CISH 敲除而上调细胞导致 IL-15 介导的 Janus 激酶信号转导和转录激活因子 (JAK-STAT) 信号传导增加，并在 AML 异种移植小鼠模型中具有优异的抗肿瘤活性。

我们小组开发了一种结合CAR19/IL- 15转导和CISH 缺失导致淋巴瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性增强。从机制上讲，我们发现NK细胞的抗肿瘤活性与增强的Akt/mTORC1和 c-MYC 信号传导以及增加的有氧糖酵解有关，从而促进它们的代谢适应性并赋予它们卓越的抗肿瘤活性。

瞄准TME

针对TME涉及针对其复杂免疫抑制网络的策略，包括免疫细胞、基质细胞、细胞因子、代谢物和调节途径。

TGF-b 是 TME 中重要的免疫抑制细胞因子。工程NK细胞表达一种源自TGF-bR2（显性阴性受体）的高亲和力非信号转导受体被证明可以中和TGF-b对NK细胞的负面影响并恢复其细胞毒性。

另一种策略针对的是微小RNA (miRNA) miR-27a 5p，在NK 细胞中被TGF-b 上调。miR-27a-5p抑制剂的核转染增加了体外和体内NK 细胞的效应子功能。我们小组使用成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 技术敲除人类NK细胞中的TGF-b受体2基因 (TGFbR2)，这使得 NK 细胞对 TGF-b 不敏感并保持其效应子激活。

腺苷是TME的另一种免疫抑制代谢物，由ATP产生，以响应缺氧和外核苷酸酶CD73和CD39的压力。阻断NK细胞上的高亲和力A2A 腺苷受体增强了它们的增殖和成熟以及它们在黑色素瘤、乳腺癌和纤维肉瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。TME 具有丰富的其他免疫抑制因子，如 IL-10、精氨酸酶-1、一氧化氮、前列腺素 E2 (PGE2)、IDO和可以通过基因工程或联合疗法靶向的活性氧，例如在过继转移的 NK 细胞中表达抗氧化剂。

MDSC是抑制抗肿瘤免疫反应的免疫调节剂，并对免疫治疗的成功构成挑战。用易普利姆玛 [抗细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4 (CTLA4)] 治疗已显示降低黑色素瘤患者中的MDSC。因此，旨在将NK细胞免疫疗法与MDSC耗竭相结合的方法可能会进一步提高反应。

Treg也是有吸引力的治疗靶点，因为它们通过不同机制抑制NK细胞活性，包括通过TGF-b产生和限制IL-2对NK细胞的可用性。化学疗法，如氟尿嘧啶 (5-FU)、环磷酰胺、多柔比星和舒尼替尼已被证明可靶向MDSC和Treg，并与NK细胞免疫疗法相结合，可能会产生更好的结果。需要强调的是，这些化疗药物仍保留其广泛的免疫抑制作用，这需要使用新技术来特异性有效地靶向和消除MDSC和Treg。

简而言之，重新编程NK细胞以规避TME强加的免疫逃避机制是提高NK细胞治疗功效的一种有前途的方法。

使用CAR工程重定向NK细胞的特异性

CAR 技术的出现极大地增强了免疫效应细胞用于过继治疗的细胞毒活性。CAR 是基因工程跨膜受体，具有两个主要功能：(i) 独立于 MHC 限制的特异性抗原识别和 (ii) 通过信号转导激活修饰细胞。

CAR T 细胞疗法在淋巴白血病和淋巴瘤以及骨髓瘤，但它们的使用与某些限制有关，包括成本以及严重的毒性，如 CRS 和神经毒性。NK 细胞是 CAR 工程的有吸引力的候选者，因为它们的寿命短，在体内持续近 2 周，并且它们不同的细胞因子谱可以降低过继转移后的毒性风险。

NK细胞的其他优势与其内在的能力有关通过自身受体识别和靶向肿瘤细胞，即使在抗原逃逸机制（如CAR靶抗原下调）进化时，它们也能杀死癌细胞。重要的是，临床前和临床数据均表明同种异体 CAR-NK的GvHD风险。这些独特的特性，包括可以以较低成本生产的现成和现成产品的潜力，使NK细胞成为CAR工程的有吸引力的竞争者。

~~本文：doi: 10.1111/bjh.17186